【摘要】：目前,硒代胱氨酸作為潛在癌癥治療藥物被深入研究。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與胱氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似,但胱氨酸中的硫元素被硒元素取代,從而形成了硒代胱氨酸特有的化學(xué)特性,但也賦予了其廣泛的生物毒性。硒代胱氨酸的化學(xué)特性和生物學(xué)特性源于其結(jié)構(gòu)中的二硒鍵。含有二硒鍵的小分子如硒代胱氨和硒代谷胱甘肽,他們?cè)诮湍负图?xì)菌中都能夠催化蛋白質(zhì)氧化折疊。相對(duì)巰基來說,硒基具有較低的酸度系數(shù)(巰基的酸度系數(shù)為8.3,硒基的酸度系數(shù)為5.2),而較低的酸度系數(shù)能夠使硒基形成穩(wěn)定的陰離子而從分子中離開,因此在氧化反應(yīng)中硒基作為離去基團(tuán)具有較大的優(yōu)勢(shì)。此外,硒基還可快速與大氣中氧氣反應(yīng)生成二硒鍵,從而在動(dòng)力學(xué)方面使氧化反應(yīng)更加有利。然而研究顯示,硒代胱氨酸對(duì)廣泛的癌細(xì)胞具有較高的毒性,其半數(shù)致死量為微摩爾數(shù)量級(jí)。但正因?yàn)槠鋵?duì)癌細(xì)胞沒有特異性,限制了它作為臨床藥物的應(yīng)用性,因此我們需要開發(fā)新的藥物載體使硒代胱氨酸具有針對(duì)單一癌細(xì)胞的特異性。從超嗜熱菌中分離純化出的二氧四氫喋啶合酶(AaLS)是一類蛋白質(zhì)衣殼,具有極大潛力被發(fā)展為納米載體用于硒代半胱氨酸的傳遞。AaLS由十二個(gè)五聚體組成具有六十個(gè)單體的蛋白衣殼。在每個(gè)五聚體的中心有一個(gè)8.9埃的小孔,小于1000 Da的小分子可以通過這個(gè)小孔進(jìn)入蛋白質(zhì)衣殼。在之前的研究中,AaLS的外表面(R108C)已經(jīng)被修飾用于連接如硼替佐米和阿霉素的抗癌藥物。為了在AaLS中引進(jìn)靶向特性,他們對(duì)兩種短肽進(jìn)行研究,其一,他們?cè)O(shè)計(jì)在70和71的位點(diǎn)引進(jìn)RGD4C環(huán)狀短肽,其可以通過二硫鍵的生成在分子內(nèi)形成一個(gè)環(huán),識(shí)別活化內(nèi)皮細(xì)胞表面過量表達(dá)的整合素αvβ3受體。其二,他們?cè)贏aLS的碳末端連接SP94短肽,它可以特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的受體從而達(dá)到靶向特性。他們對(duì)AaLS的研究展現(xiàn)了AaLS蛋白衣殼作為傳遞治療分子載體的顯著性,我們可以對(duì)AaLS進(jìn)行內(nèi)部和表面的簡(jiǎn)單修飾以提高他的載藥性能和靶向特性。在本研究中,我們所用的是一個(gè)之前已被設(shè)計(jì)的蛋白衣殼AaLS的變體AaLS-IC。AaLS-IC的內(nèi)表面具有一個(gè)單一的半胱氨酸殘基(E122C),并且去除了野生型AaLS中原有的半胱氨酸(C37A)以避免蛋白衣殼與小分子客體間的錯(cuò)誤連接。之前課題組成員用此變體AaLS蛋白衣殼包裹了一個(gè)含有巰基的小分子抗癌藥物姜黃素(Cur-SH)。通過實(shí)驗(yàn),已經(jīng)證明通過巰基與二硫鍵交換反應(yīng),可以使Cur-SH以70%的產(chǎn)率被載入AaLS-IC蛋白質(zhì)衣殼中,而Cur-SH可被5mM的TCEP在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)釋放。通過AaLS-IC的包裹,Cur-SH在水溶液中的溶解度顯著提高,因此可證明AaLS-IC可以優(yōu)化小分子作為潛在藥物的特定性能。由于硒代胱氨酸是一類潛在的抗癌藥物,但缺乏對(duì)特定細(xì)胞的靶向性,且硒代胱氨酸中二硒鍵相對(duì)于Cur-SH中的巰基來說較為穩(wěn)定,因此我們將硒代胱氨酸作為小分子藥物客體,將其與AaLS-IC中的巰基反應(yīng),并評(píng)估將AaLS-IC蛋白質(zhì)衣殼發(fā)展為藥物傳遞系統(tǒng)的可能性。硒代胱氨酸中的二硒鍵和蛋白質(zhì)衣殼中的巰基反應(yīng)熱力學(xué)上很不穩(wěn)定,但此反應(yīng)的副產(chǎn)物硒基可快速與氧氣反應(yīng)生成二硒鍵,這一過程在動(dòng)力學(xué)上為載藥反應(yīng)提供了反應(yīng)動(dòng)力。為研究硒代胱氨酸與AaLS-IC蛋白衣殼反應(yīng)的最佳條件,我們優(yōu)化了反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)物比例以得到最大化的反應(yīng)產(chǎn)率。我們用DTNB和NTSB分析結(jié)合的比色法測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)率,通過DTNB分析,我們觀測(cè)載藥后硒代胱氨酸與AaLS-IC蛋白衣殼復(fù)合物中自由巰基的量。我們發(fā)現(xiàn)隨著硒代胱氨酸與蛋白衣殼反應(yīng)比例的增加,在蛋白衣殼中有反應(yīng)活性的巰基隨之減小,并在硒代胱氨酸與蛋白衣殼反應(yīng)比例為6時(shí)達(dá)到零,表明在反應(yīng)比例為6時(shí)硒代胱氨酸已經(jīng)占據(jù)了所有在蛋白衣殼中能夠與DTNB反應(yīng)的巰基。為測(cè)定反應(yīng)時(shí)間對(duì)載藥產(chǎn)率的影響,我們也測(cè)定了在不同反應(yīng)時(shí)間下的反應(yīng)產(chǎn)率。結(jié)果表明,當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的時(shí)候,已經(jīng)沒有可與DTNB反應(yīng)的巰基殘留在蛋白衣殼中。因此我們判定最佳反應(yīng)條件為:將硒代胱氨酸與蛋白衣殼以6:1的比例混合,在室溫下反應(yīng)3小時(shí)便可達(dá)到最佳反應(yīng)產(chǎn)率。然而DTNB與AaLS-IC蛋白衣殼間的反應(yīng)并不能達(dá)到100%的產(chǎn)率,其原因還有待進(jìn)一步考量,但同時(shí)也證明DTNB分析法很有可能低估了硒代胱氨酸與蛋白衣殼間的反應(yīng)產(chǎn)率,因?yàn)槲装彼岷苡锌赡芘c一些不能和DTNB反應(yīng)的巰基進(jìn)行反應(yīng)。于是我們引進(jìn)了NTSB分析法對(duì)載藥反應(yīng)的產(chǎn)率進(jìn)行測(cè)定。NTSB不僅可與蛋白衣殼中的自由巰基,硫硒鍵進(jìn)行反應(yīng),還可與二硫鍵進(jìn)行反應(yīng),但理論上我們已知硒代胱氨酸反應(yīng)的蛋白衣殼中不存在二硫鍵。在NTSB分析法中,為準(zhǔn)確測(cè)定硫硒鍵的含量,我們先用過量的碘乙酰胺與蛋白衣殼中的自由巰基反應(yīng)以封閉自由巰基的反應(yīng)性,再將其與NTSB反應(yīng)以測(cè)定衣殼中硫硒鍵的含量。在此法中,我們可以通過測(cè)定硫硒鍵的含量直接測(cè)定載藥反應(yīng)的產(chǎn)率。以DTNB分析法測(cè)定的反應(yīng)產(chǎn)率為75%,以NTSB分析法測(cè)定的反應(yīng)產(chǎn)率為81%,由于NTSB分析法以一種更為直接的分析法測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)率,且相對(duì)于DTNB分析法來說更為準(zhǔn)確,于是我們認(rèn)為硒代胱氨酸與蛋白衣殼的最終反應(yīng)產(chǎn)率為81%。且反應(yīng)后,在蛋白衣殼中真正的客體分子為硒代半胱氨酸。同時(shí),AaLS-IC蛋白衣殼也呈現(xiàn)出了一種特殊的結(jié)構(gòu)特性,在AaLS蛋白衣殼中,我們引入了獨(dú)有的半胱氨酸殘基,為其包載硒代胱氨酸提供了化學(xué)基礎(chǔ)。堅(jiān)固的蛋白外殼降低了兩半胱氨酸結(jié)合形成分子內(nèi)二硫鍵的可能性,半胱氨酸在蛋白衣殼內(nèi)表面的位置也降低了兩半胱氨酸反應(yīng)生成分子間二硫鍵的可能。為證明這一假設(shè),我們同時(shí)設(shè)計(jì)了兩種半胱氨酸在蛋白外表面的AaLS變體。一個(gè)是五聚體AaLS-IC,其半胱氨酸的位置與AaLS-IC一致,但我們破壞了其60聚體的衣殼結(jié)構(gòu),使其不能聚集為球形衣殼,只保留五聚體蛋白質(zhì),使其巰基裸露在表面。另一個(gè)AaLS變體是AaLS-EC,在此變體中,我們保留蛋白衣殼的球形結(jié)構(gòu),但改變了半胱氨酸的位置,使其暴露在蛋白衣殼表面(E70C)。我們將硒代胱氨酸分別與這兩種AaLS變體反應(yīng),反應(yīng)條件與AaLS-IC和硒代胱氨酸的反應(yīng)一致,反應(yīng)后,我們利用SDS-PAGE和分子排阻色譜分析反應(yīng)產(chǎn)物,結(jié)果顯示,兩種反應(yīng)的產(chǎn)物中都含有部分二聚體蛋白,但AaLS-IC與硒代胱氨酸的產(chǎn)物中沒有發(fā)現(xiàn)二聚體蛋白的生成,因此半胱氨酸的位置對(duì)于載藥反應(yīng)來說極其重要,我們不能忽視位置的重要性。作為潛在的藥物傳遞系統(tǒng),我們需測(cè)定硒代半胱氨酸是否能被普通的還原試劑如谷胱甘肽從AaLS-IC衣殼中釋放出來。由于在癌細(xì)胞中谷胱甘肽的含量通常在1 mM至10 mM之間,因此我們?nèi)∮? mM的谷胱甘肽作為還原劑,測(cè)定在此濃度下的谷胱甘肽能否斷裂AaLS-IC衣殼中的硫硒鍵。結(jié)果顯示,3小時(shí)過后,已有半數(shù)硒代半胱氨酸從蛋白衣殼中釋放出來,并且在48小時(shí)內(nèi),被包裹的硒代半胱氨酸可全部從蛋白衣殼中釋放,此結(jié)果表明1 mM的谷胱甘肽已經(jīng)足夠釋放蛋白衣殼中的硒代半胱氨酸。為進(jìn)一步測(cè)定還原劑對(duì)硒代半胱氨酸釋放的影響,我們采用更強(qiáng)的還原劑二硫蘇糖醇斷裂衣殼內(nèi)的硫硒鍵,在此實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)用二硫蘇糖醇釋放的初始釋放速率較用谷胱甘肽的釋放速率有輕微的加快,但最終的釋放率相同。作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn),我們并未在硒代半胱氨酸與蛋白衣殼的復(fù)合物中加入任何還原劑,將此復(fù)合物放置48小時(shí),之后檢測(cè)游離硒代半胱氨酸的含量,結(jié)果顯示,在空白對(duì)照中并未檢測(cè)出任何游離硒代半胱氨酸的釋放。總的來說,無論用谷胱甘肽還是二硫蘇糖醇作為還原劑,硒代半胱氨酸都可完全從AaLS-IC衣殼中釋放,而空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)也證明此釋放過程可被還原劑誘導(dǎo),由于癌細(xì)胞較健康細(xì)胞有較高的谷胱甘肽含量,因此這種釋放特性可在癌細(xì)胞中得到應(yīng)用。為鑒定包裹硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣殼在細(xì)胞內(nèi)的表現(xiàn),我們進(jìn)行了細(xì)胞毒性與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。我們選取了六株細(xì)胞系,其中包括五株癌癥細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞HeLa S3,腸癌細(xì)胞HCT116,乳腺癌細(xì)胞MCF7,活躍性前列腺癌細(xì)胞PC3,惰性前列腺癌細(xì)胞LNCaP)和一株健康細(xì)胞(鼠胚胎纖維原細(xì)胞MEF),對(duì)硒代胱氨酸,包裹硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣殼和空蛋白衣殼進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)試,利用MTT法檢測(cè)活細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示硒代胱氨酸對(duì)這六個(gè)細(xì)胞系具有廣泛的細(xì)胞毒性且半數(shù)致死量在低濃度值范圍內(nèi),由此再次證明硒代胱氨酸具有較高的細(xì)胞毒性,且毒性涉及范圍較廣。包裹的硒代半胱氨酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa S3,腸癌細(xì)胞HCT116,乳腺癌細(xì)胞MCF7,活躍性前列腺癌細(xì)胞PC3都具有高低不同的毒性,由此表明AaLS-IC蛋白衣殼可以將硒代半胱氨酸傳遞進(jìn)入細(xì)胞,并釋放其中的硒代半胱氨酸,使其表達(dá)毒性作用。而未包載硒代半胱氨酸的空AaLS-IC蛋白衣殼并未對(duì)這六株細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性,從而證明包載硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣殼所表現(xiàn)的細(xì)胞毒性僅來自于在衣殼內(nèi)的硒代半胱氨酸產(chǎn)生,同時(shí)也再次證明了AaLS-IC作為潛在藥物傳遞系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)。為了進(jìn)一步探測(cè)AaLS-IC蛋白衣殼在細(xì)胞內(nèi)的位置,我們進(jìn)行了細(xì)胞攝取的實(shí)驗(yàn)。由于硒代半胱氨酸并沒有明顯的熒光或者紫外吸收,因此我們?cè)贏aLS-IC蛋白衣殼內(nèi)包裹了另一熒光分子,以便在熒光顯微鏡下觀察蛋白衣殼的位置,利用DAPI和CellTracker分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色,以便區(qū)分細(xì)胞內(nèi)各部分機(jī)體。基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)包裹硒代半胱氨酸的AaLS-IC蛋白衣殼的細(xì)胞毒性與蛋白衣殼的位置之間存在著微妙的聯(lián)系,對(duì)于包裹硒代半胱氨酸的蛋白衣殼具有較高敏感性的細(xì)胞系(IC_(50)較低),蛋白衣殼可聚積在這些細(xì)胞系的細(xì)胞核中,對(duì)于包裹硒代半胱氨酸的蛋白衣殼具有較低敏感性的細(xì)胞系(IC_(50)較高),蛋白衣殼可聚積在這些細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)中,而對(duì)于那些未能將蛋白衣殼攝取進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞系,包裹硒代半胱氨酸的蛋白衣殼則沒有對(duì)細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞毒性。這一現(xiàn)象可以幫助我們更好的對(duì)蛋白衣殼的外表面進(jìn)行進(jìn)一步設(shè)計(jì),從而賦予其對(duì)細(xì)胞的靶向特性�？偟膩碚f,我們的研究顯示了硒代半胱氨酸可以被載入AaLS-IC蛋白衣殼中,且每個(gè)蛋白衣殼可包載48個(gè)硒代半胱氨酸,包載率大約在81%。對(duì)其釋放速率的研究證明硒代半胱氨酸可以被細(xì)胞內(nèi)常見的還原劑還原型谷胱甘肽從AaLS-IC蛋白衣殼中釋放,在48小時(shí)內(nèi)可達(dá)到最大釋放產(chǎn)率。之后我們也證明衣殼內(nèi)半胱氨酸位置的重要性,設(shè)計(jì)了兩種AaLS變體,AaLS-EC和五聚體形式的AaLS-IC,以不同的角度證明了外置半胱氨酸的蛋白衣殼不可形成單一的衣殼與客體分子的復(fù)合物,在反應(yīng)過程中會(huì)有二聚體蛋白的產(chǎn)生。同時(shí),我們也從細(xì)胞毒性與細(xì)胞攝取兩個(gè)角度證明了AaLS-IC蛋白衣殼可將硒代半胱氨酸傳遞進(jìn)入細(xì)胞中,并且可展現(xiàn)出硒代半胱氨酸的毒性,而細(xì)胞毒性與蛋白衣殼在細(xì)胞內(nèi)定位之間的聯(lián)系也激勵(lì)我們進(jìn)一步修飾蛋白衣殼的外表面,使其對(duì)特定靶細(xì)胞具有特異性,從而提高硒代半胱氨酸傳遞進(jìn)入細(xì)胞的有效性與靶向性。對(duì)于具有廣泛細(xì)胞毒性的小分子潛在藥物來說,細(xì)胞攝取的特異性是其能否被用作治療分子的重要因素。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AaLS-IC有潛力被發(fā)展為一類藥物傳遞系統(tǒng),以提高潛在藥物分子的特定化學(xué)與生物特性。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2741602