【摘要】：目的:探究ACN誘導(dǎo)的腦組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響,以及NF-κB激活后對(duì)凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用,為ACN神經(jīng)毒性機(jī)制深入研究提供依據(jù)。方法:60只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為5組:對(duì)照組(玉米油)、ACN低、中、高ACN組(11.5、23.0、46.0mg/kg ACN)、NAC干預(yù)組(46.0mg/kg ACN+300mg/kg NAC),灌胃染毒,每天1次,每周6次,連續(xù)4周。末次染毒后,次日心臟采血后處死大鼠。(1)染毒前及末次染毒后,采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field test,OFT)評(píng)價(jià)大鼠自主活動(dòng)水平;(2)稱(chēng)量大鼠腦濕重,計(jì)算臟器系數(shù);(3)制備腦組織HE病理染色切片,觀察腦組織病理學(xué)改變;(4)制備腦組織勻漿,ELISA法測(cè)定大鼠腦組織內(nèi)炎癥細(xì)胞因子濃度;生化法檢測(cè)腦組織中GSH、MDA含量以及GSH-Px、SOD、CAT酶活力;(5)Real-Time PCR檢測(cè)腦組織NF-κB信號(hào)通路以及線粒體凋亡途徑相關(guān)基因IKK-α、IκB、NF-κB、TLR4、caspase-9和caspase-3 mRNA表達(dá)水平;(6)Western Blot檢測(cè)腦組織NF-κB信號(hào)通路以及線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白NF-κB、IKK-α、p-IKKα/β、IκB-α、p-IκBα、TLR4、Cyt c、caspase-9、caspase-3、Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量。(7)TUN EL法檢測(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果:(1)ACN染毒后,在OFT 0-10 min和11-20 min運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,高ACN組大鼠lardist值、總距離與對(duì)照組比較均增加(P0.05)。與高ACN組比較,NAC組大鼠在OFT 0-10 min和11-20 min運(yùn)動(dòng)過(guò)程中總距離減少(P0.05)。(2)染毒前及整個(gè)染毒過(guò)程中,各劑量組大鼠體重變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。染毒結(jié)束后,各劑量組大鼠腦臟器系數(shù)均未發(fā)生明顯變化(P0.05)。(3)HE染色可見(jiàn),中、高ACN組大鼠腦組織損傷明顯,皮層區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,胞核淡染,部分細(xì)胞軸突、尼氏體消失,并觀察到神經(jīng)細(xì)胞衛(wèi)星現(xiàn)象;海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂,層次不清,胞核淡染、胞漿模糊,細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰。與高ACN組比較,NAC組大鼠腦組織皮層區(qū)錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整,可見(jiàn)胞核、軸突,尼氏體較豐富;海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列較整齊,結(jié)構(gòu)較清晰。(4)與對(duì)照組相比,低、中、高ACN組大鼠腦組織MDA含量均升高(P0.05);中、高ACN組大鼠腦組織GSH含量降低(P0.05);高ACN組GSH-Px活力下降(P0.05);低ACN組CAT活力下降(P0.05)。與高ACN組相比,NAC組大鼠腦組織SOD活力升高,MDA含量、CAT活力降低。(5)與對(duì)照組比較,低、中、高ACN組大鼠腦組織TNF-α濃度均升高(P0.05);中、高ACN組IL-1β濃度均升高;高ACN組IL-6濃度升高(P0.05)。與高ACN組比較,NAC組大鼠腦組織中炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低(P0.05)。(6)與對(duì)照組相比,中、高ACN組IKK-α、NF-κB mRNA表達(dá)均上調(diào)(P0.05);高ACN組大鼠腦組織TLR4、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)均上調(diào)(P0.05)。與高ACN組相比,NAC組IKK-α、NF-κB、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)均下調(diào)(P0.05)。(7)與對(duì)照組相比,低、中、高ACN組p-IKKα/β、IKK-α、NF-κB、Cyt c、Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P0.05);中、高ACN組p-IκBα、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P0.05);高ACN組TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P0.05);高ACN組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P0.05)。與高ACN組比較,NAC組大鼠腦組織p-IKKα/β、NF-κB、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P0.05);Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P0.05)。(8)TUNEL染色結(jié)果顯示,中、高ACN組大鼠腦組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較顯著增加。結(jié)論:(1)ACN染毒可致大鼠自發(fā)行為改變,并使腦組織發(fā)生病理學(xué)損傷,這可能與ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān);(2)ROS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、NF-κB信號(hào)通路和線粒體凋亡通路的激活是ACN致大鼠腦損傷的機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R99
【圖文】：

第三章 結(jié)果ACN 對(duì)大鼠體重、腦組織濕重及臟器系數(shù)的影響染毒前各組大鼠體重之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。染毒過(guò)大鼠體重均有所增加， ACN 各劑量染毒組大鼠體重相比，差異均無(wú)統(tǒng)（P>0.05）。見(jiàn)圖 3.1.1。單因素方差分析結(jié)果顯示， ACN 各劑量染毒組間大鼠腦組織濕重差異學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步經(jīng)兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高 ACN組織濕重降低（P<0.05）。低、中、高 ACN 組大鼠腦臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)（P>0.05）。見(jiàn)表 3.1.1。本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生大鼠死亡，高 ACN 組大鼠染毒第二周開(kāi)始出現(xiàn)、易激惹等行為表現(xiàn)，其他組大鼠未見(jiàn)明顯行為改變。

ACN 組大鼠運(yùn)動(dòng)過(guò)程中大運(yùn)動(dòng)總時(shí)間增加；高 ACN 組大運(yùn)動(dòng)總距離均增（P<0.05）。與高 ACN 組比較，NAC 組大鼠 OFT 0-10 min和 11-20 min運(yùn)動(dòng)程中不活動(dòng)總時(shí)間、不活動(dòng)總距離、小運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、小運(yùn)動(dòng)總距離值、大運(yùn)動(dòng)時(shí)間、大運(yùn)動(dòng)總距離、總距離之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表 3.2表 3.2.2。ACN 染毒后，在 OFT 0-10 min 運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，高 ACN 組大鼠大運(yùn)動(dòng)總時(shí)間大運(yùn)動(dòng)總距離、總距離與對(duì)照組比較均增加（P<0.05）。與高 ACN 組比較，NA組大鼠在 OFT 0-10 min運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，大運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、大運(yùn)動(dòng)總距離、總距離減少。在 OFT 11-20 min運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，與對(duì)照組比較，中、高 ACN 組大鼠大動(dòng)總時(shí)間均增加；高 ACN 組總距離增加。與高 ACN 組比較，NAC 組大鼠在 O11-20 min 運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，大運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、總距離均減少（P<0.05）。見(jiàn)表 3.2.3表 3.2.4。大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡如圖 3.2.1 所示，對(duì)照組、低 ACN 組在周邊和中央?yún)^(qū)交替活動(dòng)，表現(xiàn)出正常的趨避性，同時(shí)又嘗試探索中央?yún)^(qū)域，中、高 ACN 組鼠與對(duì)照組比較多在周邊活動(dòng)，在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較少。與高 ACN 組比較，NA大鼠在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較多。

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