【摘要】：微生物是重要藥用化合物的主要來(lái)源。為挖掘更多抗腫瘤和抗細(xì)菌感染的天然活性藥物,本文從組合生物合成和基因組挖掘兩個(gè)角度來(lái)對(duì)兩類(lèi)化合物開(kāi)展研究。1蛋白酶體抑制劑類(lèi)化合物syrbactins生物合成基因簇的挖掘和組合生物合成蛋白酶體(proteasome)負(fù)責(zé)降解錯(cuò)誤折疊、過(guò)量的蛋白,是抗腫瘤藥物篩選的分子1靶標(biāo)。短肽類(lèi)化合物syrbactins家族被認(rèn)為是新一代蛋白酶體抑制先導(dǎo)化合物。它們的核心骨架(也是活性中心)十二元內(nèi)酰胺環(huán)母核的生物合成機(jī)制類(lèi)似,都由非核糖體肽合成酶(NRPS)-聚酮合酶(PKS)復(fù)合體采用模塊化組裝方式合成,這種機(jī)制可以允許利用組合生物合成技術(shù)對(duì)其聚酮或聚肽骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)效優(yōu)化。本研究目標(biāo)是通過(guò)基因組挖掘得到更多來(lái)源的syrbactins生物合成基因簇,通過(guò)理性設(shè)計(jì)和重新組合,建立syrbactins的“人工”生物合成途徑,實(shí)現(xiàn)syrbactins的構(gòu)效優(yōu)化。1.1 Syrbactins家族基因簇的挖掘和異源表達(dá):為了積累更多模塊元件,本研究首先利用GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中大量的細(xì)菌基因組及宏基因組信息進(jìn)行挖掘,利用在線(xiàn)程序Blast進(jìn)行序列比對(duì)和分析,利用antiSMASH進(jìn)行基因簇預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)了許多潛在的syrbactins生物合成基因簇,包含以前研究過(guò)的glb、syl、lmm(分別合成丁香霉素(syringolins)、滑桿菌素(glidobactins)、cepafungins 和luminmycins等化合物)以及新發(fā)現(xiàn)的Pglb(來(lái)自莢殼伯克氏菌PG1(Burkholderi 1 glumae PG1))。因在原始菌中未檢測(cè)到syrbactins家族產(chǎn)物積累,對(duì)Pglb基因簇進(jìn)行直接克隆、異源表達(dá)以及進(jìn)行啟動(dòng)子的原位插入激活等實(shí)驗(yàn),但均未能激活相應(yīng)基因簇的表達(dá)。1.2 Syrbactins家族異源表達(dá)宿主的篩選:為便于進(jìn)行不同基因簇之間組合生物合成,本研究嘗試在白色鏈霉菌J1074(StreptomycesalbuJ1074)、伯克氏菌DSM 7029(Burkholderial(DSM 7029)、天藍(lán)色天霉菌(Streptomycescoelicolor)等幾種常用宿主中異源表達(dá)syrbactins生物合成基因簇,期望找到最佳適配性的宿主,以有效表達(dá)“人工”的syrbactins生物合成基因簇。目前結(jié)果發(fā)現(xiàn):白色鏈霉菌中,syl可以表達(dá),但glb不能表達(dá);天藍(lán)色鏈霉菌中,syl和glb均不能表達(dá),伯克氏菌中syl不能表達(dá)。尚未找到能同時(shí)高效表達(dá)glb、Pglb和syl三個(gè)基因簇的宿主菌。1.3 Glidobactins生物合成基因簇的阻斷與回補(bǔ):對(duì)伯克氏菌DSM 7029基因組上glidobactins生物合成基因glbC和glbF成功進(jìn)行敲除,獲得單基因敲除突變菌株。HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn),glbC和glbF敲除突變株沒(méi)有g(shù)lidobactins產(chǎn)生,成功阻斷了 glidobactins生物合成通路,說(shuō)明glbC和glbF作為結(jié)構(gòu)基因?qū)lidobactins生物合成非常關(guān)鍵。將構(gòu)建好的glbC和glbF回補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到以上敲除突變株中,發(fā)現(xiàn):基因回補(bǔ)后能恢復(fù)glidobactins的生產(chǎn),但產(chǎn)量降低為野生型DSM 7029的10%。1.4 Glidobactins生物合成基因簇結(jié)構(gòu)基因的種間替換:以上面獲得的glbC和glbF敲除突變株為基礎(chǔ),嘗試?yán)脕?lái)自syl以及Pglb基因簇中的同源基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的種間替換(預(yù)期發(fā)生氨基酸殘基的替換):sylD(與glbC同源)、sylC(與glbF同源)和PglbC(與glbC同源)分別導(dǎo)入DSM7029敲除突變株,替換glbC和glbF。HPLC-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),種間結(jié)構(gòu)基因替換未能產(chǎn)生雜合化合物。1.5 Glidobactins生物合成基因簇模塊和結(jié)構(gòu)域替換:以直接克隆得到的glidobactins生物合成基因簇glb為基礎(chǔ),分別敲除glbC中的第二個(gè)模塊和該模塊中的腺苷�；Y(jié)構(gòu)域A;隨后將來(lái)源于syl和PglP兩個(gè)基因簇中的相應(yīng)的模塊和腺苷�；Y(jié)構(gòu)域無(wú)痕插入到glbC中,完成模塊替換。最后將構(gòu)建的“人工”生物合成基因簇導(dǎo)入到敲除了glb的DSM 7029進(jìn)行表達(dá),結(jié)果沒(méi)有預(yù)期的雜合化合物產(chǎn)生(僅產(chǎn)生了二肽結(jié)構(gòu)的化合物),說(shuō)明模塊和結(jié)構(gòu)域替換導(dǎo)致glidobactins生物合成通路中斷。為了消除不同生物來(lái)源的syrbactins生物合成基因簇GC含量以及密碼子偏好性的影響,我們對(duì)用于替換的模塊進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,然后重新進(jìn)行模塊和結(jié)構(gòu)域的替換,結(jié)果也沒(méi)有檢測(cè)到預(yù)期化合物。2異戊烯吲哚類(lèi)化合物prenylisatin的生物合成Prenylisatin是細(xì)菌來(lái)源的異戊烯吲哚類(lèi)化合物,具有抗細(xì)菌、抗真菌及細(xì)胞毒性等特性,是色氨酸在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,在不同位置發(fā)生了異戊烯基取代形成的。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列異戊烯基轉(zhuǎn)移酶,能對(duì)吲哚環(huán)上所有非橋頭原子(N-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6和C-7)進(jìn)行異戊烯化,但這類(lèi)化合物完整的生物合成通路仍未闡明。本研究目標(biāo)是利用Red/ET直接克隆技術(shù)進(jìn)行基因組挖掘,鑒定異戊烯吲哚類(lèi)化合物prenylisatin生物合成基因簇,研究其生物合成途徑,為進(jìn)行更多類(lèi)似化合物的生物合成奠定基礎(chǔ)。2.1 Prenylisatin生物合成基因簇的直接克隆和異源表達(dá):我們利用antiSMASH對(duì)放線(xiàn)菌“D74”(Streptomycesrochei)基因組進(jìn)行基因簇預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)此菌株含有大量次級(jí)代謝基因簇;對(duì)其中沉默的基因簇cluster 2進(jìn)行直接克隆,導(dǎo)入到天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)(Streptomycescoelicolor A3(2))中。HPLC-MS檢測(cè)證明:異源表達(dá)成功激活該基因簇,該化合物m/z 215.6[M+H]+,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。2.2 Prenylisatin生物合成基因簇中單個(gè)基因的功能研究:分別對(duì)prenylisatin基因簇中包含的17個(gè)基因進(jìn)行單基因同框缺失突變,獲得17個(gè)單基因突變菌株,然后進(jìn)行LC-MS分析。結(jié)果表明:三個(gè)基因isa8、iia9和isal0為prenylisatin生物合成途徑中的關(guān)鍵基因,缺失后導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物不再積累。同源性分析表明isa8和iia9分別為色氨酸合成酶和芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因。isal0功能不確定(推測(cè)編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)。3總結(jié)本研究開(kāi)展系列組合生物合成研究,利用結(jié)構(gòu)基因替換、模塊替換及結(jié)構(gòu)域替換,結(jié)合密碼子優(yōu)化等,構(gòu)建系列syrbactins人工生物合成途徑,但均未得到預(yù)期雜合化合物。Syrbactins化合物是通過(guò)NRPS-PKS雜合途徑合成的,其中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用比單一的NRPS或PKS途徑更加難以預(yù)測(cè),微小的改變也會(huì)對(duì)整個(gè)生物合成途徑產(chǎn)生巨大影響,目前有報(bào)道關(guān)于NRPS模塊替換產(chǎn)生新化合物,但罕有NRPS-PKS雜合基因簇模塊替換成功的案例報(bào)道。從放線(xiàn)菌基因組上直接捕獲了 30 kb的prenylisatin生物合成基因簇,并成功進(jìn)行異源表達(dá)和單基因敲除,鑒定三個(gè)關(guān)鍵基因(編碼色氨酸合成酶、芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶和未知功能蛋白),為異戊烯吲哚類(lèi)天然活性產(chǎn)物組合生物合成提供重要的基因資源。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;R914
【圖文】：

ｌ．ｌ．４邋Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ的生物活性及藥理逡逑Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ在不同的生物體中表現(xiàn)出強(qiáng)大的生物活性，最初將ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎｓ作逡逑為植物調(diào)節(jié)劑，ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎｓ和ｃｅｐａｆｕｎｇｉｎｓ作為抗腫瘤和抗真菌化合物。這些生逡逑物活性雖然明顯不同，但藥理機(jī)制是相同的，它們都是通過(guò)抑制真核生物２０Ｓ逡逑蛋白酶體發(fā)揮作用［２８】。２００８年，Ｇｒｏｌｌ等人報(bào)道了邋ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎＡ和ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎＡ在逡逑生化抑制實(shí)驗(yàn)中對(duì)人２０Ｓ蛋白酶體有較強(qiáng)的不可逆抑制作用［２８］。逡逑

ｒ－ｉ９９（６）邋８逡逑圖１－３幾種化學(xué)合成的ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ同系物逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ邋ａｎａｌｏｇｓ逡逑ｌ．ｌ．４邋Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ的生物活性及藥理逡逑Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ在不同的生物體中表現(xiàn)出強(qiáng)大的生物活性，最初將ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎｓ作逡逑為植物調(diào)節(jié)劑，ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎｓ和ｃｅｐａｆｕｎｇｉｎｓ作為抗腫瘤和抗真菌化合物。這些生逡逑物活性雖然明顯不同，但藥理機(jī)制是相同的，它們都是通過(guò)抑制真核生物２０Ｓ逡逑蛋白酶體發(fā)揮作用［２８】。２００８年，Ｇｒｏｌｌ等人報(bào)道了邋ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎＡ和ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎＡ在逡逑生化抑制實(shí)驗(yàn)中對(duì)人２０Ｓ蛋白酶體有較強(qiáng)的不可逆抑制作用［２８］。逡逑Ｌ１Ａ１真核細(xì)胞２０Ｓ蛋白酶體的抑制作用逡逑真核２０Ｓ蛋白酶體是一種桶形蛋白酶，由２８?jìng)�(gè)亞單位組成，這些亞單位按逡逑照順序ａｉ＿７－Ｐｉ－７＿Ｐｉ－７－ａｕ７排列，真核２０Ｓ蛋白酶體具有３個(gè)不同的蛋白水解位點(diǎn)，逡逑８逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李谷靜;;麻痹性貝毒生物合成機(jī)制的研究進(jìn)展和蛋白組學(xué)的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年20期

2 劉耘,宗敏華,杜偉;有機(jī)硅化合物的生物合成研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥物化學(xué)雜志;2000年03期

3 柳川;弘志;徐萬(wàn)祥;;最初的酶是蛋白質(zhì),還是核酸?[J];世界科學(xué);1987年08期

4 OSarmu NEGISHI;謝曉鳳;;茶提取物中黃苷的甲基化作用和咖啡堿的生物合成[J];茶業(yè)通報(bào);1987年02期

5 大村智;供田洋;陳代杰;;脂肪酸生物合成阻斷劑淺藍(lán)菌素的應(yīng)用[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1987年02期

6 田中寬;高橋秀夫;徐積恩;;放線(xiàn)菌育種的現(xiàn)狀和展望[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1987年04期

7 陳代杰;許文思;周光悹;;鹽霉素生物合成的研究[J];醫(yī)藥工業(yè);1987年01期

8 曾曉雄;茶葉香氣中萜烯物質(zhì)的生物合成及其與茶樹(shù)無(wú)性系分類(lèi)[J];福建茶葉;1988年02期

9 劉毓英;~(35)S標(biāo)記L型胱氨酸的生物合成[J];核技術(shù);1988年01期

10 廖福榮;蛋氨酸干擾產(chǎn)黃頂孢霉對(duì)纈氨酸的攝取[J];國(guó)外藥學(xué)(抗生素分冊(cè));1988年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姚戈;曹瑛;應(yīng)天翼;陳冀勝;;藍(lán)藻毒素生物合成研究進(jìn)展[A];中國(guó)藻類(lèi)學(xué)會(huì)第八次會(huì)員代表大會(huì)暨第十六次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 支慶慶;于雷;賀竹梅;;黃曲霉毒素生物合成調(diào)控機(jī)制的基因組挖掘[A];廣東省遺傳學(xué)會(huì)第九屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文及摘要匯編[C];2014年

3 肖毅;;通過(guò)基于代謝表型差異的體內(nèi)群體質(zhì)量控制技術(shù)提高生物合成效率[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第二屆青年科技論壇暨首屆青年工作委員會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2017年

4 支慶慶;賀竹梅;;黃曲霉毒素生物合成的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制初步研究[A];第12屆生物毒素研究及醫(yī)藥應(yīng)用學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2015年

5 張保才;錢(qián)前;李家洋;周奕華;;水稻中的纖維素生物合成:水稻纖維素合酶基因的功能研究[A];中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

6 周東坡;平文祥;遲彥;朱婧;趙凱;馬璽;;樹(shù)狀多節(jié)孢生物合成紫杉醇相關(guān)基因的篩選[A];第二屆中國(guó)青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

7 徐玉泉;;利用成像質(zhì)譜和組合生物合成發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制新型活性化合物[A];中國(guó)菌物學(xué)會(huì)2016年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2016年

8 劉鋼;;頭孢菌素生物合成中的自噬研究[A];遺傳多樣性：前沿與挑戰(zhàn)——中國(guó)的遺傳學(xué)研究（2013-2015）——2015中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2015年

9 李香云;余劍波;;血紅素氧合酶-1/一氧化碳系統(tǒng)對(duì)線(xiàn)粒體生物合成的影響[A];2017中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)會(huì)[CSIA]年會(huì)暨第四屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)術(shù)研討會(huì)暨陜西省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)麻醉專(zhuān)業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文資料匯編[C];2017年

10 李笑巖;曲洪林;金昌洙;袁文丹;孫旭紅;都鵬超;柴勇;;醫(yī)學(xué)概論《蛋白質(zhì)的生物合成》說(shuō)課設(shè)計(jì)[A];“決策論壇——區(qū)域發(fā)展與公共政策研究學(xué)術(shù)研討會(huì)”論文集（上）[C];2016年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 李潔尉　徐海;微生物次生代謝生物合成研究獲重大進(jìn)展[N];科學(xué)時(shí)報(bào);2011年

2 本報(bào)記者 孫玉松;“甜蜜家族”成員，“搭”上生物合成快車(chē)[N];科技日?qǐng)?bào);2019年

3 記者 胡其峰;組合生物合成研究獲重大突破[N];光明日?qǐng)?bào);2014年

4 馮衛(wèi)東;硒氨酸具有獨(dú)特的生物合成路徑[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

5 記者 蔣明 通訊員 談弋;慶大霉素生物合成機(jī)制揭示[N];健康報(bào);2014年

6 尤新;開(kāi)發(fā)有利于健康的生物合成功能配料[N];中國(guó)食品報(bào);2009年

7 ;稀有天然藥物生物合成與合成生物學(xué)研究[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2012年

8 解小如;淄博開(kāi)工生物合成柴油項(xiàng)目[N];中國(guó)化工報(bào);2006年

9 錢(qián)錚;日本新發(fā)現(xiàn)加速抗生素生物合成機(jī)制[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

10 記者 馮海波 通訊員 陳臣 鄺兆明;華工專(zhuān)家發(fā)現(xiàn)纖維素生物合成機(jī)制[N];廣東科技報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王佳;改造木糖非磷酸化代謝途徑及莽草酸途徑生物合成高附加值產(chǎn)物[D];北京化工大學(xué);2018年

2 張艷艷;milR在米爾貝霉素生物合成中的調(diào)控機(jī)制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 徐高歌;產(chǎn)酶溶桿菌OH11中第二信使c-di-GMP調(diào)控抗菌物質(zhì)HSAF生物合成的信號(hào)通路研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 蘇振賀;產(chǎn)酶溶桿菌OH11中DF（Diffusible Factor）群體感應(yīng)系統(tǒng)參與抗菌物質(zhì)HSAF生物合成的機(jī)制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 孟思童;林可霉素生物合成的高產(chǎn)及硝酸鹽效應(yīng)機(jī)制解析[D];上海交通大學(xué);2017年

6 黃勝;三環(huán)咔唑生物堿neocarazostatin A生物合成中新型級(jí)聯(lián)修飾反應(yīng)的研究[D];武漢大學(xué);2015年

7 薩巴克;菊葉薯蕷中的皂素生物合成調(diào)控研究[D];武漢大學(xué);2011年

8 沈璐妍;PGC1α介導(dǎo)線(xiàn)粒體生物合成參與人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐受機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2018年

9 廖志華;紫杉醇前體生物合成的分子生物學(xué)和抗癌萜類(lèi)吲哚生物堿的代謝工程[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

10 趙華燕;利用反義RNA技術(shù)進(jìn)行木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（植物研究所）;2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王永江;魯塔霉素生物合成研究及其生產(chǎn)菌次生代謝產(chǎn)物的挖掘[D];云南大學(xué);2018年

2 雷秀云;基于RNA-Seq技術(shù)的竹紅菌甲素和20-羥基蛻皮甾酮的生物合成研究[D];蘇州大學(xué);2017年

3 陳國(guó)鋒;黃脂菌素生物合成中調(diào)控基因的功能研究[D];上海交通大學(xué);2017年

4 劉曉彤;蛋白酶體抑制劑syrbactins的組合生物合成和prenylisatin的異源表達(dá)[D];山東大學(xué);2019年

5 劉焱;新PoTeM類(lèi)天然產(chǎn)物的發(fā)掘與生物合成[D];山東大學(xué);2019年

6 王凌云;抗腫瘤天然產(chǎn)物CC-1065和YM-216391生物合成相關(guān)基因功能研究[D];安徽大學(xué);2013年

7 司天昭;引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶在植物乳桿菌YM-4-3菌株胞外多糖生物合成中的分子調(diào)控機(jī)理研究[D];昆明理工大學(xué);2018年

8 李剛;電催化耦合生物合成體系用于CO_2到高附加值化合物轉(zhuǎn)化的研究[D];浙江大學(xué);2018年

9 柳樂(lè)璇;大腸桿菌生物合成水楊酸[D];北京化工大學(xué);2018年

10 王寧;硫化亞鐵的生物合成及催化脫氯性能探究[D];南京理工大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2736117