【摘要】：微生物是重要藥用化合物的主要來源。為挖掘更多抗腫瘤和抗細(xì)菌感染的天然活性藥物,本文從組合生物合成和基因組挖掘兩個角度來對兩類化合物開展研究。1蛋白酶體抑制劑類化合物syrbactins生物合成基因簇的挖掘和組合生物合成蛋白酶體(proteasome)負(fù)責(zé)降解錯誤折疊、過量的蛋白,是抗腫瘤藥物篩選的分子1靶標(biāo)。短肽類化合物syrbactins家族被認(rèn)為是新一代蛋白酶體抑制先導(dǎo)化合物。它們的核心骨架(也是活性中心)十二元內(nèi)酰胺環(huán)母核的生物合成機(jī)制類似,都由非核糖體肽合成酶(NRPS)-聚酮合酶(PKS)復(fù)合體采用模塊化組裝方式合成,這種機(jī)制可以允許利用組合生物合成技術(shù)對其聚酮或聚肽骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)效優(yōu)化。本研究目標(biāo)是通過基因組挖掘得到更多來源的syrbactins生物合成基因簇,通過理性設(shè)計和重新組合,建立syrbactins的“人工”生物合成途徑,實現(xiàn)syrbactins的構(gòu)效優(yōu)化。1.1 Syrbactins家族基因簇的挖掘和異源表達(dá):為了積累更多模塊元件,本研究首先利用GenBank等數(shù)據(jù)庫中大量的細(xì)菌基因組及宏基因組信息進(jìn)行挖掘,利用在線程序Blast進(jìn)行序列比對和分析,利用antiSMASH進(jìn)行基因簇預(yù)測,發(fā)現(xiàn)了許多潛在的syrbactins生物合成基因簇,包含以前研究過的glb、syl、lmm(分別合成丁香霉素(syringolins)、滑桿菌素(glidobactins)、cepafungins 和luminmycins等化合物)以及新發(fā)現(xiàn)的Pglb(來自莢殼伯克氏菌PG1(Burkholderi 1 glumae PG1))。因在原始菌中未檢測到syrbactins家族產(chǎn)物積累,對Pglb基因簇進(jìn)行直接克隆、異源表達(dá)以及進(jìn)行啟動子的原位插入激活等實驗,但均未能激活相應(yīng)基因簇的表達(dá)。1.2 Syrbactins家族異源表達(dá)宿主的篩選:為便于進(jìn)行不同基因簇之間組合生物合成,本研究嘗試在白色鏈霉菌J1074(StreptomycesalbuJ1074)、伯克氏菌DSM 7029(Burkholderial(DSM 7029)、天藍(lán)色天霉菌(Streptomycescoelicolor)等幾種常用宿主中異源表達(dá)syrbactins生物合成基因簇,期望找到最佳適配性的宿主,以有效表達(dá)“人工”的syrbactins生物合成基因簇。目前結(jié)果發(fā)現(xiàn):白色鏈霉菌中,syl可以表達(dá),但glb不能表達(dá);天藍(lán)色鏈霉菌中,syl和glb均不能表達(dá),伯克氏菌中syl不能表達(dá)。尚未找到能同時高效表達(dá)glb、Pglb和syl三個基因簇的宿主菌。1.3 Glidobactins生物合成基因簇的阻斷與回補:對伯克氏菌DSM 7029基因組上glidobactins生物合成基因glbC和glbF成功進(jìn)行敲除,獲得單基因敲除突變菌株。HPLC-MS分析發(fā)現(xiàn),glbC和glbF敲除突變株沒有g(shù)lidobactins產(chǎn)生,成功阻斷了 glidobactins生物合成通路,說明glbC和glbF作為結(jié)構(gòu)基因?qū)lidobactins生物合成非常關(guān)鍵。將構(gòu)建好的glbC和glbF回補表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到以上敲除突變株中,發(fā)現(xiàn):基因回補后能恢復(fù)glidobactins的生產(chǎn),但產(chǎn)量降低為野生型DSM 7029的10%。1.4 Glidobactins生物合成基因簇結(jié)構(gòu)基因的種間替換:以上面獲得的glbC和glbF敲除突變株為基礎(chǔ),嘗試?yán)脕碜詓yl以及Pglb基因簇中的同源基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的種間替換(預(yù)期發(fā)生氨基酸殘基的替換):sylD(與glbC同源)、sylC(與glbF同源)和PglbC(與glbC同源)分別導(dǎo)入DSM7029敲除突變株,替換glbC和glbF。HPLC-MS檢測發(fā)現(xiàn),種間結(jié)構(gòu)基因替換未能產(chǎn)生雜合化合物。1.5 Glidobactins生物合成基因簇模塊和結(jié)構(gòu)域替換:以直接克隆得到的glidobactins生物合成基因簇glb為基礎(chǔ),分別敲除glbC中的第二個模塊和該模塊中的腺苷酰化結(jié)構(gòu)域A;隨后將來源于syl和PglP兩個基因簇中的相應(yīng)的模塊和腺苷�；Y(jié)構(gòu)域無痕插入到glbC中,完成模塊替換。最后將構(gòu)建的“人工”生物合成基因簇導(dǎo)入到敲除了glb的DSM 7029進(jìn)行表達(dá),結(jié)果沒有預(yù)期的雜合化合物產(chǎn)生(僅產(chǎn)生了二肽結(jié)構(gòu)的化合物),說明模塊和結(jié)構(gòu)域替換導(dǎo)致glidobactins生物合成通路中斷。為了消除不同生物來源的syrbactins生物合成基因簇GC含量以及密碼子偏好性的影響,我們對用于替換的模塊進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,然后重新進(jìn)行模塊和結(jié)構(gòu)域的替換,結(jié)果也沒有檢測到預(yù)期化合物。2異戊烯吲哚類化合物prenylisatin的生物合成Prenylisatin是細(xì)菌來源的異戊烯吲哚類化合物,具有抗細(xì)菌、抗真菌及細(xì)胞毒性等特性,是色氨酸在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,在不同位置發(fā)生了異戊烯基取代形成的。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列異戊烯基轉(zhuǎn)移酶,能對吲哚環(huán)上所有非橋頭原子(N-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6和C-7)進(jìn)行異戊烯化,但這類化合物完整的生物合成通路仍未闡明。本研究目標(biāo)是利用Red/ET直接克隆技術(shù)進(jìn)行基因組挖掘,鑒定異戊烯吲哚類化合物prenylisatin生物合成基因簇,研究其生物合成途徑,為進(jìn)行更多類似化合物的生物合成奠定基礎(chǔ)。2.1 Prenylisatin生物合成基因簇的直接克隆和異源表達(dá):我們利用antiSMASH對放線菌“D74”(Streptomycesrochei)基因組進(jìn)行基因簇預(yù)測,發(fā)現(xiàn)此菌株含有大量次級代謝基因簇;對其中沉默的基因簇cluster 2進(jìn)行直接克隆,導(dǎo)入到天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)(Streptomycescoelicolor A3(2))中。HPLC-MS檢測證明:異源表達(dá)成功激活該基因簇,該化合物m/z 215.6[M+H]+,與文獻(xiàn)報道一致。2.2 Prenylisatin生物合成基因簇中單個基因的功能研究:分別對prenylisatin基因簇中包含的17個基因進(jìn)行單基因同框缺失突變,獲得17個單基因突變菌株,然后進(jìn)行LC-MS分析。結(jié)果表明:三個基因isa8、iia9和isal0為prenylisatin生物合成途徑中的關(guān)鍵基因,缺失后導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物不再積累。同源性分析表明isa8和iia9分別為色氨酸合成酶和芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因。isal0功能不確定(推測編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)。3總結(jié)本研究開展系列組合生物合成研究,利用結(jié)構(gòu)基因替換、模塊替換及結(jié)構(gòu)域替換,結(jié)合密碼子優(yōu)化等,構(gòu)建系列syrbactins人工生物合成途徑,但均未得到預(yù)期雜合化合物。Syrbactins化合物是通過NRPS-PKS雜合途徑合成的,其中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用比單一的NRPS或PKS途徑更加難以預(yù)測,微小的改變也會對整個生物合成途徑產(chǎn)生巨大影響,目前有報道關(guān)于NRPS模塊替換產(chǎn)生新化合物,但罕有NRPS-PKS雜合基因簇模塊替換成功的案例報道。從放線菌基因組上直接捕獲了 30 kb的prenylisatin生物合成基因簇,并成功進(jìn)行異源表達(dá)和單基因敲除,鑒定三個關(guān)鍵基因(編碼色氨酸合成酶、芳香族異戊烯轉(zhuǎn)移酶和未知功能蛋白),為異戊烯吲哚類天然活性產(chǎn)物組合生物合成提供重要的基因資源。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;R914
【圖文】：

ｌ．ｌ．４邋Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ的生物活性及藥理逡逑Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ在不同的生物體中表現(xiàn)出強大的生物活性，最初將ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎｓ作逡逑為植物調(diào)節(jié)劑，ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎｓ和ｃｅｐａｆｕｎｇｉｎｓ作為抗腫瘤和抗真菌化合物。這些生逡逑物活性雖然明顯不同，但藥理機(jī)制是相同的，它們都是通過抑制真核生物２０Ｓ逡逑蛋白酶體發(fā)揮作用［２８】。２００８年，Ｇｒｏｌｌ等人報道了邋ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎＡ和ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎＡ在逡逑生化抑制實驗中對人２０Ｓ蛋白酶體有較強的不可逆抑制作用［２８］。逡逑

ｒ－ｉ９９（６）邋８逡逑圖１－３幾種化學(xué)合成的ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ同系物逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ邋ａｎａｌｏｇｓ逡逑ｌ．ｌ．４邋Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ的生物活性及藥理逡逑Ｓｙｒｂａｃｔｉｎｓ在不同的生物體中表現(xiàn)出強大的生物活性，最初將ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎｓ作逡逑為植物調(diào)節(jié)劑，ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎｓ和ｃｅｐａｆｕｎｇｉｎｓ作為抗腫瘤和抗真菌化合物。這些生逡逑物活性雖然明顯不同，但藥理機(jī)制是相同的，它們都是通過抑制真核生物２０Ｓ逡逑蛋白酶體發(fā)揮作用［２８】。２００８年，Ｇｒｏｌｌ等人報道了邋ｓｙｒｉｎｇｏｌｉｎＡ和ｇｌｉｄｏｂａｃｔｉｎＡ在逡逑生化抑制實驗中對人２０Ｓ蛋白酶體有較強的不可逆抑制作用［２８］。逡逑Ｌ１Ａ１真核細(xì)胞２０Ｓ蛋白酶體的抑制作用逡逑真核２０Ｓ蛋白酶體是一種桶形蛋白酶，由２８個亞單位組成，這些亞單位按逡逑照順序ａｉ＿７－Ｐｉ－７＿Ｐｉ－７－ａｕ７排列，真核２０Ｓ蛋白酶體具有３個不同的蛋白水解位點，逡逑８逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李谷靜;;麻痹性貝毒生物合成機(jī)制的研究進(jìn)展和蛋白組學(xué)的應(yīng)用[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年20期

2 劉耘,宗敏華,杜偉;有機(jī)硅化合物的生物合成研究進(jìn)展[J];中國藥物化學(xué)雜志;2000年03期

3 柳川;弘志;徐萬祥;;最初的酶是蛋白質(zhì),還是核酸?[J];世界科學(xué);1987年08期

4 OSarmu NEGISHI;謝曉鳳;;茶提取物中黃苷的甲基化作用和咖啡堿的生物合成[J];茶業(yè)通報;1987年02期

5 大村智;供田洋;陳代杰;;脂肪酸生物合成阻斷劑淺藍(lán)菌素的應(yīng)用[J];國外藥學(xué)(抗生素分冊);1987年02期

6 田中寬;高橋秀夫;徐積恩;;放線菌育種的現(xiàn)狀和展望[J];國外藥學(xué)(抗生素分冊);1987年04期

7 陳代杰;許文思;周光悹;;鹽霉素生物合成的研究[J];醫(yī)藥工業(yè);1987年01期

8 曾曉雄;茶葉香氣中萜烯物質(zhì)的生物合成及其與茶樹無性系分類[J];福建茶葉;1988年02期

9 劉毓英;~(35)S標(biāo)記L型胱氨酸的生物合成[J];核技術(shù);1988年01期

10 廖福榮;蛋氨酸干擾產(chǎn)黃頂孢霉對纈氨酸的攝取[J];國外藥學(xué)(抗生素分冊);1988年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 姚戈;曹瑛;應(yīng)天翼;陳冀勝;;藍(lán)藻毒素生物合成研究進(jìn)展[A];中國藻類學(xué)會第八次會員代表大會暨第十六次學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2011年

2 支慶慶;于雷;賀竹梅;;黃曲霉毒素生物合成調(diào)控機(jī)制的基因組挖掘[A];廣東省遺傳學(xué)會第九屆代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文及摘要匯編[C];2014年

3 肖毅;;通過基于代謝表型差異的體內(nèi)群體質(zhì)量控制技術(shù)提高生物合成效率[A];中國生物工程學(xué)會第二屆青年科技論壇暨首屆青年工作委員會學(xué)術(shù)年會論文集[C];2017年

4 支慶慶;賀竹梅;;黃曲霉毒素生物合成的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制初步研究[A];第12屆生物毒素研究及醫(yī)藥應(yīng)用學(xué)術(shù)大會論文集[C];2015年

5 張保才;錢前;李家洋;周奕華;;水稻中的纖維素生物合成:水稻纖維素合酶基因的功能研究[A];中國植物生理學(xué)會第十次會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)年會論文摘要匯編[C];2009年

6 周東坡;平文祥;遲彥;朱婧;趙凱;馬璽;;樹狀多節(jié)孢生物合成紫杉醇相關(guān)基因的篩選[A];第二屆中國青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

7 徐玉泉;;利用成像質(zhì)譜和組合生物合成發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制新型活性化合物[A];中國菌物學(xué)會2016年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2016年

8 劉鋼;;頭孢菌素生物合成中的自噬研究[A];遺傳多樣性：前沿與挑戰(zhàn)——中國的遺傳學(xué)研究（2013-2015）——2015中國遺傳學(xué)會大會論文摘要匯編[C];2015年

9 李香云;余劍波;;血紅素氧合酶-1/一氧化碳系統(tǒng)對線粒體生物合成的影響[A];2017中國中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)會[CSIA]年會暨第四屆全國中西醫(yī)結(jié)合麻醉學(xué)術(shù)研討會暨陜西省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會麻醉專業(yè)委員會成立大會論文資料匯編[C];2017年

10 李笑巖;曲洪林;金昌洙;袁文丹;孫旭紅;都鵬超;柴勇;;醫(yī)學(xué)概論《蛋白質(zhì)的生物合成》說課設(shè)計[A];“決策論壇——區(qū)域發(fā)展與公共政策研究學(xué)術(shù)研討會”論文集（上）[C];2016年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 李潔尉　徐海;微生物次生代謝生物合成研究獲重大進(jìn)展[N];科學(xué)時報;2011年

2 本報記者 孫玉松;“甜蜜家族”成員，“搭”上生物合成快車[N];科技日報;2019年

3 記者 胡其峰;組合生物合成研究獲重大突破[N];光明日報;2014年

4 馮衛(wèi)東;硒氨酸具有獨特的生物合成路徑[N];科技日報;2009年

5 記者 蔣明 通訊員 談弋;慶大霉素生物合成機(jī)制揭示[N];健康報;2014年

6 尤新;開發(fā)有利于健康的生物合成功能配料[N];中國食品報;2009年

7 ;稀有天然藥物生物合成與合成生物學(xué)研究[N];中國醫(yī)藥報;2012年

8 解小如;淄博開工生物合成柴油項目[N];中國化工報;2006年

9 錢錚;日本新發(fā)現(xiàn)加速抗生素生物合成機(jī)制[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2006年

10 記者 馮海波 通訊員 陳臣 鄺兆明;華工專家發(fā)現(xiàn)纖維素生物合成機(jī)制[N];廣東科技報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王佳;改造木糖非磷酸化代謝途徑及莽草酸途徑生物合成高附加值產(chǎn)物[D];北京化工大學(xué);2018年

2 張艷艷;milR在米爾貝霉素生物合成中的調(diào)控機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 徐高歌;產(chǎn)酶溶桿菌OH11中第二信使c-di-GMP調(diào)控抗菌物質(zhì)HSAF生物合成的信號通路研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 蘇振賀;產(chǎn)酶溶桿菌OH11中DF（Diffusible Factor）群體感應(yīng)系統(tǒng)參與抗菌物質(zhì)HSAF生物合成的機(jī)制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 孟思童;林可霉素生物合成的高產(chǎn)及硝酸鹽效應(yīng)機(jī)制解析[D];上海交通大學(xué);2017年

6 黃勝;三環(huán)咔唑生物堿neocarazostatin A生物合成中新型級聯(lián)修飾反應(yīng)的研究[D];武漢大學(xué);2015年

7 薩巴克;菊葉薯蕷中的皂素生物合成調(diào)控研究[D];武漢大學(xué);2011年

8 沈璐妍;PGC1α介導(dǎo)線粒體生物合成參與人卵巢癌細(xì)胞順鉑耐受機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2018年

9 廖志華;紫杉醇前體生物合成的分子生物學(xué)和抗癌萜類吲哚生物堿的代謝工程[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

10 趙華燕;利用反義RNA技術(shù)進(jìn)行木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究[D];中國科學(xué)院研究生院（植物研究所）;2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王永江;魯塔霉素生物合成研究及其生產(chǎn)菌次生代謝產(chǎn)物的挖掘[D];云南大學(xué);2018年

2 雷秀云;基于RNA-Seq技術(shù)的竹紅菌甲素和20-羥基蛻皮甾酮的生物合成研究[D];蘇州大學(xué);2017年

3 陳國鋒;黃脂菌素生物合成中調(diào)控基因的功能研究[D];上海交通大學(xué);2017年

4 劉曉彤;蛋白酶體抑制劑syrbactins的組合生物合成和prenylisatin的異源表達(dá)[D];山東大學(xué);2019年

5 劉焱;新PoTeM類天然產(chǎn)物的發(fā)掘與生物合成[D];山東大學(xué);2019年

6 王凌云;抗腫瘤天然產(chǎn)物CC-1065和YM-216391生物合成相關(guān)基因功能研究[D];安徽大學(xué);2013年

7 司天昭;引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶在植物乳桿菌YM-4-3菌株胞外多糖生物合成中的分子調(diào)控機(jī)理研究[D];昆明理工大學(xué);2018年

8 李剛;電催化耦合生物合成體系用于CO_2到高附加值化合物轉(zhuǎn)化的研究[D];浙江大學(xué);2018年

9 柳樂璇;大腸桿菌生物合成水楊酸[D];北京化工大學(xué);2018年

10 王寧;硫化亞鐵的生物合成及催化脫氯性能探究[D];南京理工大學(xué);2018年

本文編號：2736117