【摘要】：鐵是一種維持身體多種功能所需的元素,如DNA的合成和修復(fù),氧氣的輸送和線粒體能量代謝等。鐵代謝是通過鐵調(diào)素(Hepcidin)來進(jìn)行調(diào)節(jié)的。鐵調(diào)素是一種多肽類激素,對鐵代謝起負(fù)調(diào)控作用。鐵調(diào)素能夠與肝細(xì)胞表面的膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin 1,FPN1)結(jié)合,促進(jìn)FPN1的內(nèi)化和降解從而調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)。正常生理狀況下,機(jī)體鐵調(diào)素表達(dá)與血清鐵水平呈負(fù)反饋關(guān)系。當(dāng)血清鐵過載時(shí),肝臟合成分泌鐵調(diào)素增多,加速了 FPN1的降解,即關(guān)閉了鐵向血液中轉(zhuǎn)運(yùn)的出口,從而減少了小腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向血液中輸送鐵;當(dāng)血清鐵不足時(shí),肝臟表達(dá)鐵調(diào)素量減少,FPN1通道開放增多,肝臟中儲存的鐵向血液中轉(zhuǎn)運(yùn)增加,同時(shí)小腸加大對鐵的吸收,進(jìn)而維持鐵穩(wěn)態(tài)。慢性病性貧血(anemia of chronic disease,ACD)是鐵調(diào)素失衡所導(dǎo)致的一類重要疾病,其發(fā)病原因主要是炎癥刺激或慢性感染、腫瘤等因素導(dǎo)致的鐵代謝紊亂。鐵調(diào)素作為一種急性應(yīng)激蛋白參與調(diào)控機(jī)體鐵平衡。目前研究表明,鐵調(diào)素的升高在ACD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)機(jī)體受到如敗血癥、燒傷、炎性腸病等炎癥或慢性感染刺激時(shí),炎性細(xì)胞因子IL-6通過JAK-STAT信號通路刺激鐵調(diào)素的表達(dá),肝臟合成分泌的鐵調(diào)素增多。患者體內(nèi)血清鐵調(diào)素顯著升高,抑制了小腸上皮細(xì)胞攝取食物鐵及巨噬細(xì)胞釋放鐵的過程,同時(shí),鐵被封閉于肝臟組織中難以被機(jī)體利用,最終導(dǎo)致低鐵血癥,誘發(fā)缺鐵性貧血,表現(xiàn)為血清鐵降低,組織中儲存鐵難以釋放及炎性介質(zhì)表達(dá)量增高等多種病理特征。但已有的治療手段無法對慢性病貧血進(jìn)行治療,只能通過治療炎癥來達(dá)到治療目的。多種信號通路參與從鐵調(diào)素基因表達(dá)、分泌、成熟為具有生物活性的鐵調(diào)素過程,這些通路主要包括HJV(hemojuvelin鐵調(diào)素調(diào)節(jié)蛋白)-BMP(bone morphogenetic protein 骨形態(tài)發(fā)生蛋白)/SMAD(drosophila mothers against decapentaplegic)信號通路、弗林蛋白酶(Furin)-HJV信號通路等。此外,跨膜絲氨酸蛋白 6(transmembrane protease serines 6,TMPRSS6)、機(jī)體鐵水平,炎癥因子等均是影響對鐵調(diào)素表達(dá)的因素。研究表明,肝素具有較好的抑制鐵調(diào)素活性,然而肝素強(qiáng)大的抗凝活性使其抗鐵調(diào)素活性的應(yīng)用受到出血風(fēng)險(xiǎn)的影響,因此研發(fā)具有低抗凝活性且高抗鐵調(diào)素活性的肝素衍生物成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),肝素葡糖醛酸鄰二醇斷裂的衍生物(glycol-split heparin,Gs-Hp)具有較低的抗凝活性和較好的抗鐵調(diào)素活性,而進(jìn)一步進(jìn)行N-乙�；母嗡匮苌锟硅F調(diào)素的作用較弱。Gs-Hp可以快速有效的抑制肝臟中鐵調(diào)素的表達(dá),促進(jìn)肝臟等儲鐵器官中的鐵向血液中的轉(zhuǎn)運(yùn),從而增加血液中的流通鐵。在化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥的小鼠體內(nèi),該肝素衍生物抑制SMAD-BMP6通路,減少體內(nèi)鐵調(diào)素的含量,其作用機(jī)制類似于鐵調(diào)素結(jié)合蛋白HJV,靶向于BMP-HJV-SMAD通路,抑制IL-6和鐵對鐵調(diào)素的誘導(dǎo)作用。Gs-Hp較肝素相比降低了抗凝活性,同時(shí)保持了其高抗鐵調(diào)素活性和抗炎、抗腫瘤作用,因此有望研發(fā)為一種治療癌癥和慢性病引起的貧血的新藥�；诖�,本課題擬研制一種肝素鐵復(fù)合物,既能夠降低肝素的抗凝活性,又能夠保持肝素的抗鐵調(diào)素活性,同時(shí)還能補(bǔ)充貧血患者體內(nèi)缺乏的流通鐵,從而達(dá)到治療慢性病貧血的目的。本課題以肝素鈉為對照,通過①考察肝素鐵對HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素表達(dá)的影響;②考察肝素鐵對小鼠慢性炎癥性貧血模型以及急性炎癥貧血模型的作用,探討其抗鐵調(diào)素活性以及抗炎癥貧血的作用。本研究取得的主要成果有以下幾方面:1.肝素鐵的制備與穩(wěn)定性考察通過超聲的方法將肝素鈉溶液與DHOF溶液混合制得4種肝素鐵復(fù)合物,并通過粒徑與電位,以及透射電鏡的測定,確定其結(jié)構(gòu)為球狀納米顆粒。4種肝素鐵復(fù)合物粒徑均小于10Onm,且電位相對較大,結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。此種方法所需原料易得,實(shí)驗(yàn)步驟較為簡單易行。經(jīng)過8周的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察,所制得的肝素鐵納米復(fù)合物在室溫條件下均保持澄清透明,無肉眼可見聚沉。經(jīng)過粒徑與電位測定的考察,發(fā)現(xiàn)肝素鐵納米復(fù)合物粒徑隨著時(shí)間的變化均有所增加,但仍然保持在200nm以內(nèi),具有較好的生物活性,說明本研究所制得的肝素鐵納米復(fù)合物具有較好的穩(wěn)定性。2.肝素鐵體內(nèi)外抗凝活性的檢測通過肝素鐵體內(nèi)外抗凝效價(jià)的檢測,發(fā)現(xiàn)所獲得的肝素鐵能夠大幅度減少肝素的抗凝活性,通過羊血漿抗凝實(shí)驗(yàn)與抗FXa、抗FIIa活性檢測,發(fā)現(xiàn)肝素鐵的抗凝效價(jià)降低至肝素的一半,肝素鐵2抗FXa活性為95U/mg,肝素鐵2抗FⅡa活性為85U/mg;小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,肝素鐵與肝素鈉相比,能顯著縮短小鼠尾部出血時(shí)間(P0.001)。這些結(jié)果表明本課題所制得的肝素鐵具有較好的掩蔽肝素抗凝效果的作用,可以應(yīng)用于小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),從而減少肝素的出血風(fēng)險(xiǎn)。3.MTT法測定肝素鐵納米復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞HepG2增殖的影響采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測了肝素鈉及4個(gè)肝素鐵復(fù)合物對HepG2細(xì)胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn),0-50μg/mL的肝素及肝素鐵復(fù)合物作用48h后,均對腫瘤細(xì)胞的增殖均未表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P＞0.05)。其中,在高濃度(50μg/mL)時(shí),肝素鐵4具有明顯的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用(P0.05),說明所合成的肝素鐵納米顆粒均無明顯的細(xì)胞毒性。4.qRT-PCR法測定肝素鐵對HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素mRNA的影響通過qRT-PCR的方法在HepG2細(xì)胞中考察4個(gè)肝素鐵的抗鐵調(diào)素活性,結(jié)果表明在沒有IL-6刺激時(shí),給藥濃度低于0.5μg/mL時(shí),4個(gè)肝素鐵即表現(xiàn)出較好的降低鐵調(diào)素mRNA表達(dá)的作用。在體外模擬炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中,在有IL-6的刺激下,給予0.4μg/mL肝素鐵2后,HepG2細(xì)胞中鐵調(diào)素mRNA表達(dá)量達(dá)到最低。其作用結(jié)果與肝素鈉類似,說明本課題合成的肝素鐵能夠保持肝素鈉的抗鐵調(diào)素活性。5.ELISA法測定肝素鐵對HepG2細(xì)胞鐵調(diào)素表達(dá)的影響采用ELISA法測定肝素鐵對鐵調(diào)素表達(dá)的影響,將HepG2細(xì)胞與IL-6-起孵育,肝素鐵及肝素鈉分別與50ng/mLIL-6 一起作用于HepG2細(xì)胞16小時(shí),測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中鐵調(diào)素的表達(dá)量。結(jié)果表明,在給予1.6μg/mL時(shí),肝素鐵呈現(xiàn)出抑制鐵調(diào)素蛋白表達(dá)的作用,當(dāng)肝素鐵濃度達(dá)到6.4μg/mL,鐵調(diào)素蛋白水平與正常組鐵調(diào)素水平相當(dāng),說明本課題研制的肝素鐵復(fù)合物具有降低炎癥反應(yīng)中鐵調(diào)素表達(dá)的作用。6.肝素鐵對慢性炎癥貧血小鼠血紅蛋白含量的影響采用松節(jié)油注射小鼠雙肩胛骨脂肪墊法復(fù)制小鼠炎癥貧血模型。結(jié)果表明,炎癥貧血模型組小鼠血紅蛋白水平降低至9.8pg/L,與正常組血紅蛋白水平(13 pg/L-15pg/L)相比,差異顯著(P0.01);炎癥貧血小鼠給予肝素鈉和肝素鐵干預(yù),每天尾靜脈注射6mg/Kg的肝素鐵、肝素鈉,持續(xù)給藥4周。與炎癥貧血模型組小鼠相比,肝素鈉組和肝素鐵組小鼠的血紅蛋白水平均顯著提高(P0.01),由8.2pg/L分別提高至11.7pg/L、11.6pg/L,這表明肝素鐵具有和肝素鈉類似的活性,能夠改善炎癥所致貧血。7.肝素鐵對慢性炎癥貧血小鼠血清中鐵調(diào)素含量的影響采用松節(jié)油注射小鼠雙肩胛骨脂肪墊法復(fù)制小鼠炎癥貧血模型。結(jié)果表明,炎癥貧血模型組小鼠鐵調(diào)素水平升高至23ng/mL,與正常組(5ng/mL)相比,差異顯著(P＜0.001)。對炎癥貧血小鼠給予肝素鈉和肝素鐵干預(yù),每天尾靜脈注射6mg/Kg的肝素鐵和肝素鈉,持續(xù)給藥4周。肝素鈉組與肝素鐵低劑量給藥組小鼠鐵調(diào)素水平分別降低至8ng/mL和9ng/mL,與正常對照組小鼠的鐵調(diào)素水平5ng/mL相比無顯著差異(P0.05)。這表明,肝素鈉和肝素鐵均具有顯著的降低炎癥貧血中鐵調(diào)素含量的作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),對于炎癥貧血小鼠升高的鐵調(diào)素水平,給予EPO、雙氯芬酸鈉干預(yù),均不具有降低炎癥貧血模型中鐵調(diào)素表達(dá)的作用。8.肝素鐵對急性炎癥模型小鼠中鐵調(diào)素表達(dá)作用通路的影響采用腹腔注射LPS法復(fù)制小鼠急性炎癥貧血模型。結(jié)果表明,急性炎癥貧血模型組小鼠與正常組相比,Id1 mRNA、Socs3 mRNA、Crp mRNA、Hamp mRNA的含量均顯著升高(P0.01)。對急性炎癥貧血小鼠給予肝素鈉和肝素鐵干預(yù),腹腔注射0.06mg/mL肝素鐵、肝素鈉溶液0.2mL,肝素鐵和肝素鈉組小鼠Id1mRNA、Socs3mRNA、CrpmRNA、HampmRNA 的含量較模型組小鼠均顯著降低(P＜0.01),與正常對照組小鼠的Id1mRNA、Socs3mRNA、CrpmRNA、HampmRNA水平相比無顯著差異(P0.05)。此結(jié)果表明肝素鐵與肝素鈉抑制Id1 mRNA 的 BMP/SMAD 途徑,Socs3 mRNA 的 STAT3 途徑,Crp mRNA 影響的NF-kB通路。肝素鐵與肝素鈉通過抑制這三種通路來緩解炎癥癥狀,減少炎癥反應(yīng)中鐵調(diào)素的表達(dá)量�？傊�,在本課題研制了一種安全的鐵調(diào)素抑制劑——肝素鐵,通過抑制BMP/SMAD以及JAK/STAT3通路抑制鐵調(diào)素的表達(dá),從而發(fā)揮糾正小鼠慢性炎癥貧血的作用,顯示出成為靶向抑制鐵調(diào)素治療炎癥貧血的新藥潛力。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

其中，Ｈｅｐｃｉｄｍ－２５，含有２５個(gè)氨基酸，為發(fā)揮調(diào)節(jié)鐵代謝作用的主要形逡逑式，其多肽序列中含有８個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，并通過４個(gè)分子內(nèi)二硫鍵逡逑連接ｍ，使分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如圖１－１所示［８］。目前，其他３種鐵調(diào)素亞型結(jié)構(gòu)逡逑也己經(jīng)闡明，分別含有２０，邋２２和２４個(gè)氨基酸。在正常生理?xiàng)l件下，這些亞型在逡逑尿液和血漿中含量較低，而在病理過程中含量增加。由２０個(gè)氨基酸組成的鐵調(diào)逡逑素異構(gòu)體勹血漿肌酸酐水平升高有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明［９，１Ｇ］。在無脊椎動物逡逑中發(fā)現(xiàn)的由２４個(gè)氨基酸組成的鐵調(diào)素異構(gòu)體，主要作用為激活無脊椎動物的幾逡逑種免疫學(xué)途徑。在人體中，該亞型參與鐵代謝，類似ｆＨｅｐｃｉｄｉｎ－２５。研究表明，逡逑鐵調(diào)素主要在肝細(xì)胞合成，脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、胰逡逑腺（３細(xì)胞和腎細(xì)胞也可以合成［｜１，｜２］。逡逑丨邋Ｉ邋

其中，Ｈｅｐｃｉｄｍ－２５，含有２５個(gè)氨基酸，為發(fā)揮調(diào)節(jié)鐵代謝作用的主要形逡逑式，其多肽序列中含有８個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，并通過４個(gè)分子內(nèi)二硫鍵逡逑連接ｍ，使分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如圖１－１所示［８］。目前，其他３種鐵調(diào)素亞型結(jié)構(gòu)逡逑也己經(jīng)闡明，分別含有２０，邋２２和２４個(gè)氨基酸。在正常生理?xiàng)l件下，這些亞型在逡逑尿液和血漿中含量較低，而在病理過程中含量增加。由２０個(gè)氨基酸組成的鐵調(diào)逡逑素異構(gòu)體勹血漿肌酸酐水平升高有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明［９，１Ｇ］。在無脊椎動物逡逑中發(fā)現(xiàn)的由２４個(gè)氨基酸組成的鐵調(diào)素異構(gòu)體，主要作用為激活無脊椎動物的幾逡逑種免疫學(xué)途徑。在人體中，該亞型參與鐵代謝，類似ｆＨｅｐｃｉｄｉｎ－２５。研究表明，逡逑鐵調(diào)素主要在肝細(xì)胞合成，脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、胰逡逑腺（３細(xì)胞和腎細(xì)胞也可以合成［｜１，｜２］。逡逑丨邋Ｉ邋

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2735959