【摘要】：癌癥作為一個日益嚴重的全球健康問題,每年都影響著數(shù)百萬人。其中,肝癌是世界上第五大常見惡性腫瘤,也是導致死亡的第二大原因。在臨床醫(yī)生和科學家的共同努力下,肝癌的總體生存率得以延長。然而,在治療過程中,放療和化療藥物造成的的不良反應,大大降低了患者的生存率。因此,迫切需要研究新的藥物來提高我們診斷、預防和治療肝癌的能力。納米粒子作為運載工具為醫(yī)學診斷和治療提供了巨大的潛力。銀納米和金納米具有良好的生物相容性、低毒性和功能多樣性,并且在生物醫(yī)學領域有著廣泛的應用。由于金納米顆粒表面積大,能被多種治療藥物包覆,因此在藥物傳遞系統(tǒng)中具有廣闊的應用前景。最近的研究表明,金納米顆粒已被報道應用于抗腫瘤治療,包括癌癥抗原和佐劑的傳遞。根據(jù)金納米顆粒的特性,本實驗室猜想納米技術是否可以應用于增強白藜蘆醇的抗腫瘤作用。白藜蘆醇是一種天然的化合物,存在于漿果、堅果、虎杖和葡萄中。近年來,大量的研究表明白藜蘆醇具有多種藥理學效應,包括潛在的抗癌、抗炎、心臟保護和神經(jīng)保護活性。但是,白藜蘆醇難溶于水和生物利用度低的特點大大限制了它的應用。目前,有很多研究者通過對白藜蘆醇進行修飾來改善它的缺點�；谶@些發(fā)現(xiàn),本課題在體外和體內(nèi)進行了一系列研究,以探討金納米顆粒是否可用于增強Res的抗腫瘤作用。本實驗利用白藜蘆醇自身具備的還原性,以白藜蘆醇和氯金酸溶液為原料,在37℃、質量比為1:2、反應時間為120 min的條件下,一步法制備粒徑均一、分散性良好的金納米荷載白藜蘆醇。紫外光譜結果表明金納米荷載白藜蘆醇的等離子共振吸收峰在539 nm處出現(xiàn)。透射電鏡實驗結果表明通過調節(jié)反應溫度、時間和質量比可以得到粒徑在39 nm的金納米荷載白藜蘆醇。另外,紅外光譜實驗數(shù)據(jù)表明金與白藜蘆醇酚羥基結構中氧的協(xié)同作用,使白藜蘆醇包裹在金納米粒子表面,白藜蘆醇中的碳碳雙鍵和羥基得到了保留,并且已有大量研究表明碳碳雙鍵和羥基在白藜蘆醇發(fā)揮很多藥理作用中起到重要的作用。因此,我們預測金納米荷載白藜蘆醇可能具有白藜蘆醇的部分藥理作用和金納米顆粒的優(yōu)良特性,在抗腫瘤方面具有良好的應用前景。MTT實驗檢測白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇對Hepg2細胞生長的影響;AO染色法檢測藥物對肝癌細胞形態(tài)的影響;流式細胞儀檢測肝癌細胞的凋亡情況;透射電鏡檢測金納米荷載白藜蘆醇在Hepg2細胞內(nèi)的分布情況;蛋白印跡免疫法(Western Blot)檢測Caspase家族和PI3K/Akt等相關凋亡蛋白的變化;MTT實驗檢測白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇對正常肝細胞L02和腎小球系膜GMCs細胞的毒性作用。在以上實驗的基礎上,用BALB/c裸鼠構建人肝癌Hepg2細胞荷瘤模型,持續(xù)給予藥物42天,處死荷瘤裸鼠,剝離瘤體,HE染色觀察腫瘤組織的形態(tài)學變化;Tunel染色檢測腫瘤組織中細胞凋亡的情況;免疫組化法檢測瘤體中血管生長因子(VEGF)的表達。摘取動物的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟,HE切片染色觀察受試物對上述器官組織形態(tài)學改變的影響,同時用MTT法檢測藥物對L02和GMCs細胞的毒性。MTT結果表明白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇對Hepg2細胞均具有明顯的抑制作用,并且金納米荷載白藜蘆醇的抑制作用更顯著。白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇處理Hepg2細胞24 h后,半數(shù)抑制濃度(IC_(50))分別為27.74g/ml和3.84g/ml,為了進一步檢測白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇對L02細胞和GMCs細胞的毒性作用,分別用白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇處理24 h,金納米荷載白藜蘆醇對L02細胞和GMCs細胞的抑制率依次為35%和10%,而白藜蘆醇組的抑制率依次為83%和63%。AO染色結果表明兩種藥物均能夠促進細胞凋亡,導致細胞發(fā)生形態(tài)學改變,給藥后Hepg2細胞的細胞核膜皺縮,細胞體積變小而呈綠色的熒光,凋亡細胞呈碎片狀。隨著給藥濃度的遞增,其凋亡細胞數(shù)也相應增加。透射電鏡結果表明功能化的金納米荷載白藜蘆醇在細胞內(nèi)大量積累,并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。流式細胞儀結果也表明細胞的凋亡有顯著的劑量依賴性。WB檢測相關蛋白發(fā)現(xiàn),金納米荷載白藜蘆醇可顯著上調激活的caspase-3、caspase-8、caspase-9與bax和下調PI3K與Akt的表達。白藜蘆醇對上述蛋白的調節(jié)也呈相同趨勢,但調節(jié)作用弱于金納米荷載白藜蘆醇。荷瘤實驗結束后,剝離瘤體并稱重。發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇對瘤體的生長均有較強抑制作用。白藜蘆醇組和金納米荷載白藜蘆醇組中裸鼠移植瘤體的體積和重量均明顯的降低,對瘤重的抑制率分別為35.5%和57.2%。荷瘤組織經(jīng)HE染色后,結果顯示,模型組腫瘤組織中的細胞排列整齊,細胞形態(tài)完整;給藥組的細胞隨著濃度的遞增細胞數(shù)量逐漸減少,細胞核膜皺縮,呈均勻藍色,相較于白藜蘆醇組,金納米荷載白藜蘆醇組誘導細胞凋亡的效果更加顯著;HE染色結果表明,發(fā)現(xiàn)金納米荷載白藜蘆醇對裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟無明顯毒性。Tunel檢測的凋亡細胞呈棕色或棕黃色,白藜蘆醇組和金納米荷載白藜蘆醇組凋亡細胞的比例分別為50.2%和65.8%,均比正常組明顯增加。免疫組化檢測結果也表明金納米荷載白藜蘆醇可顯著抑制VEGF的表達。蛋白免疫印記法結果表明,Caspase家族相關凋亡蛋白和PI3K/Akt信號通路在促進肝癌細胞中發(fā)揮重要的作用,并且金納米荷載白藜蘆醇對腫瘤組織中caspase-8、caspase-9、caspase-3、bax、PI3K和Akt蛋白的調節(jié)作用強于白藜蘆醇。體內(nèi)外實驗結果表明白藜蘆醇和金納米荷載白藜蘆醇均可顯著抑制Hepg2細胞和肝癌移植瘤體的生長,并且金納米荷載白藜蘆醇的抗腫瘤效果要優(yōu)于白藜蘆醇,其作用機制可能與調節(jié)線粒體相關凋亡蛋白有關。另外,金納米荷載白藜蘆醇對L02細胞、GMCs和裸鼠的臟器均沒有明顯的毒性作用。因此,金納米荷載白藜蘆醇作為治療或者輔助治療肝癌的藥物可能會有潛在的價值。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96
【圖文】：

第 3 章 金納米荷載白藜蘆醇的制備與表征屏幕轉到測定界面，之后初始化儀器。白片和 Res-GNPs 樣品壓片。含樣品的溴化鉀空片放入光譜儀樣品倉內(nèi)的下的背景按鈕，輸入光譜名稱，確認采集參完畢后，將待測樣品片放入光譜儀內(nèi)，關上分析處理。成功制備，本實驗成功制備了 Res-GNPs 溶液。探索 R觀察溶液顏色的變化，既該溶液變?yōu)榫萍t色質量比 1:2 和反應 120 min 的條件下，可以制紅色溶液。

圖 3.2 Res-GNPs 的激光粒度儀和紫外光譜儀表征Figure 3.2 the microscopic characterization of Res-GNPs. (A) The zeta potential distribution of Res-GNPs insolution. (B) UV-vis spectrum of Res-GNPs in aqueous solution.3.3.3 透射電子顯微鏡對 Res-GNPs 的表征TEM 在形貌、粒子尺寸、成分和性質等材料分析領域中發(fā)揮著重要作用。本實驗利用白藜蘆醇自身具備的還原性，以 Res 和氯金酸溶液為原料，一步法制備粒徑大小均一、分散性良好的球型 Res-GNPs。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊琪;趙星皓;卓少元;;Caspase-1與腫瘤相關性研究進展[J];中華中醫(yī)藥學刊;2019年01期

2 張詩田;張達;牛文彥;;肥胖患者炎性單核細胞Caspase活性的研究[J];天津醫(yī)科大學學報;2017年02期

3 李學玲;董紅芬;;血清IL-18、Caspase-3水平與新生兒缺氧缺血性腦病的相關性[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2016年03期

4 張瀟月;孔慶宏;王冠林;張寬仁;;Procaspase-8/Caspase-8非凋亡作用的研究進展[J];生命的化學;2016年05期

5 黃巧麗;周華;李濤;;Caspase的非凋亡性作用[J];生命的化學;2015年03期

6 Fatih 噻elik;Fatih Ulas;Zeynep Günes 銉zünal;Tülin F|rat;Serdal 噻elebi;

本文編號：2735856