【摘要】：糖尿病是人類最重要的一種慢性代謝性疾病。生活水平的提高和生活方式的改變導致的營養(yǎng)過剩和運動缺乏是誘發(fā)2型糖尿病和肥胖的最重要因素。微血管和大血管循環(huán)障礙帶來的糖尿病綜合癥是糖尿病發(fā)病和死亡的主要原因。病理生理學研究發(fā)現糖尿病的發(fā)生主要是由于胰島素分泌不足和受體敏感性下降,即胰島素抵抗。在正常情況下,胰島素結合至胰島素受體能夠激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)信號通路。該通路中的一個關鍵性激酶是AKT,激活AKT能夠促進葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)從細胞漿轉移至細胞膜上,從而增加葡萄糖吸收。另外,AKT能促進進入細胞內的葡萄糖合成為糖原;AKT同時還能抑制肝細胞內的糖異生從而減少葡萄糖釋放。在胰島素抵抗的情況下,胰島素刺激其受體的敏感性下降,導致AKT的磷酸化水平增加不明顯,AKT活化能力不足,調控血糖水平能力下降從而導致血糖升高,即糖尿病。S6K1(p70 S6激酶)是PI-3K通路中的一個重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶,該酶在營養(yǎng)過剩的情況下持續(xù)性過度激活,顯著降低胰島素受體的敏感性,誘發(fā)2型糖尿病和肥胖。S6K1下游的一個重要底物是胰島素受體底物(IRS-1)。S6K1磷酸化IRS-1的S1101位點,降低IRS-1的穩(wěn)定性,抑制IRS-1與磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)的p85亞單位的結合。抑制S6K1活性會反饋性激活PI-3K信號通路,增加葡萄糖吸收。S6K1在糖尿病的發(fā)病機理中發(fā)揮重要的作用,S6K1抑制劑可增加胰島素受體的敏感性從而增加葡萄糖吸收并降低血糖水平。S6K1在肥胖的發(fā)病機理中也起著非常重要的作用。S6K1基因缺陷型的小鼠能夠抵抗高脂肪飼料誘導的肥胖和2型糖尿病。一方面主要是由于S6K]參與脂肪干細胞的分化;另一方面,近年來研究發(fā)現在腫瘤細胞和神經元細胞中,S6K1抑制劑抑制S6K1活性后,導致AMPK激活進而誘導自噬。在脂肪細胞中,含脂滴的自噬小體與溶酶體融合后將對甘油三酯進行降解。鑒于此,我們推測S6K1抑制劑可能會抑制脂肪細胞的分化并通過誘導自噬促進脂滴的降解。近來研究發(fā)現抗類風濕性關節(jié)炎(RA)藥物來氟米特(leflunomide)及其活性代謝產物A77 1726能抑制S6K1活性。由于來氟米特是一個人工合成的化合物,本研究擬從植物抽提的化合物中遴選出一個S6K1抑制劑并研究其是否具有調控血糖的效果。我們對發(fā)表的文獻進行搜索,發(fā)現生姜提取物姜烯酮A(GinA)是一個S6K1抑制劑。本研究以2型糖尿病小鼠模型、肌管細胞和脂肪細胞為研究對象,使用這兩個S6K1抑制劑,通過蛋白免疫印跡、免疫共沉淀、免疫熒光、葡萄糖耐受試驗(GTT)和胰島素耐受試驗(ITT)等技術手段,揭示S6K1抑制劑對2型糖尿病和肥胖中關鍵信號蛋白和功能的影響,以期闡明S6K1抑制劑治療2型糖尿病和肥胖的臨床前藥效及其分子機制,為抗糖尿病和抗肥胖藥物的研發(fā)提供理論依據和新思路。具體研究分為以下三個部分:1.來氟米特的降血糖作用及其機理研究為研究來氟米特對2型糖尿病小鼠的降血糖作用及其分子機制,我們在體外試驗中以3T3-LI脂肪細胞、C2C12和L6肌管細胞為細胞模型,用來氟米特的活性代謝產物A77 1726處理細胞,運用蛋白免疫印跡檢測胰島素信號通路和PI-3K通路相關蛋白的磷酸化水平;運用免疫共沉淀檢測PI-3激酶的p85亞基與IRS-1的結合;運用免疫熒光檢測GLUT4的移位情況,同時運用同位素示蹤檢測葡萄糖的吸收情況。在體內試驗中我們建立了高脂肪飲食(HFD)誘導的2型糖尿病小鼠模型,并且應用了 ob/ob小鼠,在來氟米特灌胃3d后,檢測小鼠血糖水平并分別進行GTT和ITT測定,同時檢測ob/ob小鼠體內AKT的磷酸化水平。結果表明,A77 1726能增加AKTS473/T308和S6KIT389的磷酸化水平,并降低S6S235/236和IRS-IS1101的磷酸化水平。A77 1726能增加胰島素受體的酪氨酸磷酸化水平以及PI-3激酶p85亞基與IRS-1的結合。在L6細胞中,A77 1726能增強胰島素刺激的GLUT4轉移至細胞膜上。在L6肌管細胞和3T3-L1脂肪細胞中,A77 1726能增強胰島素刺激的葡萄糖吸收。ob/ob和HFD飼喂的小鼠口服灌胃來氟米特后,小鼠血糖恢復到正常水平并能克服GTT和ITT中的胰島素抵抗,且對正常飲食飼喂的小鼠沒有影響。來氟米特能增加ob/ob小鼠脂肪和肌肉中AKTS473/T308的磷酸化水平,但對正常小鼠無影響。本研究表明來氟米特通過抑制S6K1活性來致敏胰島素受體,并且來氟米特對于治療同時患有RA和糖尿病的患者具有潛在的意義。2.Gin A通過抑制S6K1致敏胰島素受體并增加葡萄糖吸收為闡明Gin A對葡萄糖吸收的作用及其分子機制,我們以3T3-L1脂肪細胞和L6肌管細胞為細胞模型,用GinA處理細胞,通過蛋白免疫印跡檢測信號通路相關蛋白的磷酸化水平,用免疫共沉淀檢測PI-3激酶的p85亞基與IRS-1的結合;運用免疫熒光檢測GLUT4的移位情況,同時用2-NBDG化學發(fā)光法檢測葡萄糖的吸收情況。蛋白免疫印跡結果顯示,Gin A能增加AKTS473和S6KIT389的磷酸化水平并降低S6S235/236和IRS-1S1101的磷酸化水平,表明Gin A能反饋性激活PI-3激酶。蛋白免疫印跡和免疫共沉淀結果顯示,Gin A能增加胰島素受體的酪氨酸磷酸化以及PI3K的p85亞基與IRS-1的結合。免疫熒光試驗結果表明,Gin A能增強胰島素誘導的GLUT4移位至細胞膜上。2-NBDG熒光測定結果顯示Gin A能增強3T3-L1脂肪細胞和L6肌管細胞中胰島素刺激的葡萄糖吸收。本研究表明,Gin A通過抑制S6K1致敏胰島素受體并增加體外葡萄糖吸收。Gin A對糖尿病有潛在的治療作用。3.來氟米特以自噬-溶酶體途徑促進脂質代謝為揭示來氟米特對脂質代謝的作用及其作用機理,我們在體外以3T3-L1脂肪細胞為細胞模型,用來氟米特的活性代謝產物A77 1726處理細胞,運用蛋白免疫印跡檢測自噬相關蛋白的表達水平以及AMPK信號通路蛋白的磷酸化水平;運用免疫熒光檢測自噬小體與溶酶體、自噬小體與脂滴的共定位情況;同時運用脂滴油紅染色檢測脂滴降解情況。蛋白免疫印跡結果顯示,A77 1726能顯著增加自噬標志物LC3 II的表達,并以時間和劑量依賴方式增加AMPKT172和ULKS555的磷酸化水平。通過Bafilomycin阻斷自噬小體和溶酶體結合、GFP-RFP-LC3雙熒光標記以及自噬小體和溶酶體的共定位試驗,表明A77 1726能激活AMPK并誘導完全自噬。脂滴油紅染色和自噬小體與脂滴共定位試驗結果表明,A771726介導的自噬通過溶酶體降解脂滴。本研究表明,A77 1726通過激活3T3-L1脂肪細胞AMPK并以自噬-溶酶體途徑調節(jié)脂質代謝。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R965

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