【摘要】：跨膜蛋白屬于膜蛋白的一種,是鑲嵌于脂質(zhì)雙分子層中,兩端暴露于細胞膜內(nèi)外表面的蛋白質(zhì),在維持細胞功能方面起到十分重要的作用。跨膜蛋白是目前最主要的藥物作用靶點,占到現(xiàn)階段所有已知藥靶的70%。因此,基于跨膜蛋白的藥物發(fā)現(xiàn)是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要途徑,也一直是世界范圍藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。本課題著眼于跨膜蛋白,建立了一種新型的跨膜蛋白-脂質(zhì)體生物色譜系統(tǒng),并從以下三個方面開展論述。1、新型跨膜蛋白-脂質(zhì)體-硅膠固定相合成與方法學(xué)考察跨膜蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具有一個或多個疏水性的跨膜區(qū),其純化重組以及保存都離不開去污劑的存在。但是在去污劑存在的環(huán)境下,蛋白的結(jié)構(gòu)和功能均遭到一定的破壞,藥物與跨膜蛋白的相互作用也與體內(nèi)實際情況差別較大。針對體外模擬跨膜蛋白天然構(gòu)建這一難題,相關(guān)學(xué)者發(fā)展了一系列新的模型和分析技術(shù),其中最具有代表性的就是蛋白脂質(zhì)體重構(gòu)技術(shù),其原理是使用各種脂質(zhì)體重組形成模擬細胞膜環(huán)境的人工膜,然后將跨膜蛋白鑲嵌于其上,體外模擬跨膜蛋白天然構(gòu)建和環(huán)境,來表征其與藥物的相互作用。然而,蛋白脂質(zhì)體不具備剛性結(jié)構(gòu),不能作為色譜固定相,因此無法適用于快速便捷的液質(zhì)聯(lián)用這類高效的藥物分析方法。為了解決這個問題,本章參考了蛋白脂質(zhì)體重構(gòu)技術(shù)以及本課題組先前已有基礎(chǔ)的細胞膜色譜技術(shù),選用細菌視紫紅質(zhì)作為模型蛋白,構(gòu)建了一種新型的細菌視紫紅質(zhì)-脂質(zhì)體-硅膠固定相,其原理是使用薄膜超聲水化法將多種脂質(zhì)體結(jié)合制備成囊泡狀并將細菌視紫紅質(zhì)蛋白鑲嵌于其上,而后使用真空渦旋法將細菌視紫紅質(zhì)-脂質(zhì)體復(fù)合物鍵合上硅膠。制備的同時使用粒徑測試儀,掃描電鏡,共聚焦顯微鏡等多種方式考察制備路徑中的各項物理參數(shù)。固定相制備完成后,使用濕法裝柱將合成的固定相填裝進色譜柱,使用9-順式視黃醛作為陽性藥,地塞米松作為陰性藥考察色譜柱的有效性,使用9-順式視黃醛連續(xù)進樣7天考察色譜柱壽命。一系列實驗證明,該方法成功將蛋白,脂質(zhì)體,硅膠三者結(jié)合到一起,制備了一種可以作為色譜固定相的新型復(fù)合物,通過液質(zhì)聯(lián)用進行驗證也證明其有效性和壽命符合要求,為之后該方法的進一步推廣和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2、全二維FZD4-C18柱/TOF-MS色譜系統(tǒng)細胞膜色譜法是生物色譜法的一種,具有快速、靈敏的特點,十分適用于中藥復(fù)雜體系的活性成分篩選。然而,盡管細胞膜色譜已經(jīng)經(jīng)過多年發(fā)展,其仍然有兩點不足,一是靶細胞膜上含有成百上千種跨膜蛋白,藥物與靶蛋白結(jié)合的專屬性會受到干擾。即使是外源性轉(zhuǎn)入特定蛋白表達載體的高表達細胞系,也無法消除大量細胞生存必須的其它跨膜蛋白的影響。二是靶細胞膜上的目標跨膜蛋白無法準確定量,且蛋白本身豐度低,相互作用分析的準確度和靈敏度會受到影響。因此,本章節(jié)在課題組前期細胞膜色譜研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合上一章節(jié)的新型固定相研究,發(fā)展了一種新型的全二維跨膜蛋白-脂質(zhì)體生物色譜系統(tǒng)。本課題選取卷曲蛋白受體4,建立了全二維FZD4-C18柱/TOF-MS色譜系統(tǒng)。FZD4是七次跨膜蛋白,屬于卷曲蛋白家族的一員,有眾多研究證明FZD4是通過影響WNT/β-catenin通路從而導(dǎo)致結(jié)腸腺癌,膀胱癌等癌癥的潛在靶點。通過構(gòu)建的全二維色譜系統(tǒng),篩選中藥葛根、黃芩中作用于FZD4蛋白的潛在抗癌活性成分。通過事先建立的中藥成分數(shù)據(jù)庫與質(zhì)譜結(jié)果的比對,再排除于空白對照色譜上呈陽性保留的假陽性結(jié)果后,本章節(jié)在全二維FZD4色譜系統(tǒng)上發(fā)現(xiàn)葛根中的潛在活性成分5種,黃芩中的潛在活性成分7種。3、葛根、黃芩中與FZD4可能存在相互作用的活性成分的藥效驗證本課題已經(jīng)于上一章節(jié)建立了全二維FZD4-C18柱/TOF-MS色譜系統(tǒng),并從中藥葛根、黃芩中篩選與FZD4存在相互作用的潛在抗癌活性成分,從這些成分中挑選能夠購買得到的部分成分的標準品即葛根中的葛根素和3'-羥基葛根素,黃芩中的千層紙素A、漢黃芩素與棕櫚酸甲酯進行后續(xù)實驗。為了驗證這些成分的抗癌活性,本章節(jié)選取人乳腺癌細胞,進行了一系列實驗。首先,細胞增殖抑制實驗結(jié)果顯示千層紙素A、漢黃芩素和葛根素對MCF7細胞具有殺傷作用。其次,使用流式細胞儀進行細胞凋亡實驗,結(jié)果顯示千層紙素A、漢黃芩素和葛根素是通過凋亡途徑殺傷細胞。隨后進行的蛋白免疫印跡實驗結(jié)果顯示漢黃芩素與葛根素能顯著降低MCF7細胞中FZD4的表達,其余化合物則不能。最后,使用Discovery Studio 3.0軟件進行漢黃芩素、葛根素與FZD4蛋白的虛擬對接,結(jié)果顯示漢黃芩素、葛根素能通過氫鍵與FZD4蛋白結(jié)合位點的氨基酸相連。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

圖 2-1 不同超聲時間下脂質(zhì)體的粒徑（數(shù)據(jù)表示為三次實驗的平均值±標準差n=3）。Figure 2-1 the size of liposome with different ultrasonic time. Data were expressedmean ±SD (n=3).確定脂質(zhì)體破碎所需的時間后，對該條件下制備的脂質(zhì)體用激光粒度分析儀進一步檢測，結(jié)果如表 2-1 所示，其粒徑在 200nm 以下，Zeta 電位為負值，PDI<說明制備的脂質(zhì)體符合實驗所需要求。之后總計十天都對脂質(zhì)體的這三個參數(shù)進測，結(jié)果如圖 2-2 所示。從圖中可以看出粒徑，Zeta 電位，PDI 的值在 10 天中有一些變化，但仍保持粒徑在 200nm 以下，Zeta 電位為負值，PDI<0.3，尚在可用的范圍內(nèi)，其穩(wěn)定性符合要求。

-18-圖 2-2 脂質(zhì)體的（A）粒徑，（B）PDI，（C）電位值在 10 天中的變化趨勢（數(shù)據(jù)表示為三次實驗的平均值±標準差, n=3）。Figure 2-2 The changing trend of the (A) size, (B) PDI, (C) ZP (mV) of liposome in10 days. Data were expressed as mean ±SD (n=3).（二）掃描電鏡能譜一體機的檢測結(jié)果脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物制備完成后，使用掃描電鏡能譜一體機對其進行驗證，并比較純硅膠和復(fù)合物的區(qū)別。分別取純硅膠粉末微量以及混懸的脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物 μL 與于檢測膠條上，真空噴金處理 10 min 后進行檢測，其微觀形態(tài)如圖 2-3 所示。從圖中可以看出，在 20000 倍放大條件下，硅膠表面相對較為光滑，而復(fù)合物表面能看到有明顯包裹及附著的物質(zhì)，證明脂質(zhì)體確實包裹于硅膠表面。硅膠及復(fù)合物的表

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本文編號：2733913