【摘要】：跨膜蛋白屬于膜蛋白的一種,是鑲嵌于脂質(zhì)雙分子層中,兩端暴露于細(xì)胞膜內(nèi)外表面的蛋白質(zhì),在維持細(xì)胞功能方面起到十分重要的作用。跨膜蛋白是目前最主要的藥物作用靶點(diǎn),占到現(xiàn)階段所有已知藥靶的70%。因此,基于跨膜蛋白的藥物發(fā)現(xiàn)是創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要途徑,也一直是世界范圍藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題著眼于跨膜蛋白,建立了一種新型的跨膜蛋白-脂質(zhì)體生物色譜系統(tǒng),并從以下三個(gè)方面開(kāi)展論述。1、新型跨膜蛋白-脂質(zhì)體-硅膠固定相合成與方法學(xué)考察跨膜蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜,具有一個(gè)或多個(gè)疏水性的跨膜區(qū),其純化重組以及保存都離不開(kāi)去污劑的存在。但是在去污劑存在的環(huán)境下,蛋白的結(jié)構(gòu)和功能均遭到一定的破壞,藥物與跨膜蛋白的相互作用也與體內(nèi)實(shí)際情況差別較大。針對(duì)體外模擬跨膜蛋白天然構(gòu)建這一難題,相關(guān)學(xué)者發(fā)展了一系列新的模型和分析技術(shù),其中最具有代表性的就是蛋白脂質(zhì)體重構(gòu)技術(shù),其原理是使用各種脂質(zhì)體重組形成模擬細(xì)胞膜環(huán)境的人工膜,然后將跨膜蛋白鑲嵌于其上,體外模擬跨膜蛋白天然構(gòu)建和環(huán)境,來(lái)表征其與藥物的相互作用。然而,蛋白脂質(zhì)體不具備剛性結(jié)構(gòu),不能作為色譜固定相,因此無(wú)法適用于快速便捷的液質(zhì)聯(lián)用這類高效的藥物分析方法。為了解決這個(gè)問(wèn)題,本章參考了蛋白脂質(zhì)體重構(gòu)技術(shù)以及本課題組先前已有基礎(chǔ)的細(xì)胞膜色譜技術(shù),選用細(xì)菌視紫紅質(zhì)作為模型蛋白,構(gòu)建了一種新型的細(xì)菌視紫紅質(zhì)-脂質(zhì)體-硅膠固定相,其原理是使用薄膜超聲水化法將多種脂質(zhì)體結(jié)合制備成囊泡狀并將細(xì)菌視紫紅質(zhì)蛋白鑲嵌于其上,而后使用真空渦旋法將細(xì)菌視紫紅質(zhì)-脂質(zhì)體復(fù)合物鍵合上硅膠。制備的同時(shí)使用粒徑測(cè)試儀,掃描電鏡,共聚焦顯微鏡等多種方式考察制備路徑中的各項(xiàng)物理參數(shù)。固定相制備完成后,使用濕法裝柱將合成的固定相填裝進(jìn)色譜柱,使用9-順式視黃醛作為陽(yáng)性藥,地塞米松作為陰性藥考察色譜柱的有效性,使用9-順式視黃醛連續(xù)進(jìn)樣7天考察色譜柱壽命。一系列實(shí)驗(yàn)證明,該方法成功將蛋白,脂質(zhì)體,硅膠三者結(jié)合到一起,制備了一種可以作為色譜固定相的新型復(fù)合物,通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行驗(yàn)證也證明其有效性和壽命符合要求,為之后該方法的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2、全二維FZD4-C18柱/TOF-MS色譜系統(tǒng)細(xì)胞膜色譜法是生物色譜法的一種,具有快速、靈敏的特點(diǎn),十分適用于中藥復(fù)雜體系的活性成分篩選。然而,盡管細(xì)胞膜色譜已經(jīng)經(jīng)過(guò)多年發(fā)展,其仍然有兩點(diǎn)不足,一是靶細(xì)胞膜上含有成百上千種跨膜蛋白,藥物與靶蛋白結(jié)合的專屬性會(huì)受到干擾。即使是外源性轉(zhuǎn)入特定蛋白表達(dá)載體的高表達(dá)細(xì)胞系,也無(wú)法消除大量細(xì)胞生存必須的其它跨膜蛋白的影響。二是靶細(xì)胞膜上的目標(biāo)跨膜蛋白無(wú)法準(zhǔn)確定量,且蛋白本身豐度低,相互作用分析的準(zhǔn)確度和靈敏度會(huì)受到影響。因此,本章節(jié)在課題組前期細(xì)胞膜色譜研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合上一章節(jié)的新型固定相研究,發(fā)展了一種新型的全二維跨膜蛋白-脂質(zhì)體生物色譜系統(tǒng)。本課題選取卷曲蛋白受體4,建立了全二維FZD4-C18柱/TOF-MS色譜系統(tǒng)。FZD4是七次跨膜蛋白,屬于卷曲蛋白家族的一員,有眾多研究證明FZD4是通過(guò)影響WNT/β-catenin通路從而導(dǎo)致結(jié)腸腺癌,膀胱癌等癌癥的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建的全二維色譜系統(tǒng),篩選中藥葛根、黃芩中作用于FZD4蛋白的潛在抗癌活性成分。通過(guò)事先建立的中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)與質(zhì)譜結(jié)果的比對(duì),再排除于空白對(duì)照色譜上呈陽(yáng)性保留的假陽(yáng)性結(jié)果后,本章節(jié)在全二維FZD4色譜系統(tǒng)上發(fā)現(xiàn)葛根中的潛在活性成分5種,黃芩中的潛在活性成分7種。3、葛根、黃芩中與FZD4可能存在相互作用的活性成分的藥效驗(yàn)證本課題已經(jīng)于上一章節(jié)建立了全二維FZD4-C18柱/TOF-MS色譜系統(tǒng),并從中藥葛根、黃芩中篩選與FZD4存在相互作用的潛在抗癌活性成分,從這些成分中挑選能夠購(gòu)買得到的部分成分的標(biāo)準(zhǔn)品即葛根中的葛根素和3'-羥基葛根素,黃芩中的千層紙素A、漢黃芩素與棕櫚酸甲酯進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證這些成分的抗癌活性,本章節(jié)選取人乳腺癌細(xì)胞,進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先,細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示千層紙素A、漢黃芩素和葛根素對(duì)MCF7細(xì)胞具有殺傷作用。其次,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示千層紙素A、漢黃芩素和葛根素是通過(guò)凋亡途徑殺傷細(xì)胞。隨后進(jìn)行的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示漢黃芩素與葛根素能顯著降低MCF7細(xì)胞中FZD4的表達(dá),其余化合物則不能。最后,使用Discovery Studio 3.0軟件進(jìn)行漢黃芩素、葛根素與FZD4蛋白的虛擬對(duì)接,結(jié)果顯示漢黃芩素、葛根素能通過(guò)氫鍵與FZD4蛋白結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸相連。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R91
【圖文】：

圖 2-1 不同超聲時(shí)間下脂質(zhì)體的粒徑（數(shù)據(jù)表示為三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差n=3）。Figure 2-1 the size of liposome with different ultrasonic time. Data were expressedmean ±SD (n=3).確定脂質(zhì)體破碎所需的時(shí)間后，對(duì)該條件下制備的脂質(zhì)體用激光粒度分析儀進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果如表 2-1 所示，其粒徑在 200nm 以下，Zeta 電位為負(fù)值，PDI<說(shuō)明制備的脂質(zhì)體符合實(shí)驗(yàn)所需要求。之后總計(jì)十天都對(duì)脂質(zhì)體的這三個(gè)參數(shù)進(jìn)測(cè)，結(jié)果如圖 2-2 所示。從圖中可以看出粒徑，Zeta 電位，PDI 的值在 10 天中有一些變化，但仍保持粒徑在 200nm 以下，Zeta 電位為負(fù)值，PDI<0.3，尚在可用的范圍內(nèi)，其穩(wěn)定性符合要求。

-18-圖 2-2 脂質(zhì)體的（A）粒徑，（B）PDI，（C）電位值在 10 天中的變化趨勢(shì)（數(shù)據(jù)表示為三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3）。Figure 2-2 The changing trend of the (A) size, (B) PDI, (C) ZP (mV) of liposome in10 days. Data were expressed as mean ±SD (n=3).（二）掃描電鏡能譜一體機(jī)的檢測(cè)結(jié)果脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物制備完成后，使用掃描電鏡能譜一體機(jī)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，并比較純硅膠和復(fù)合物的區(qū)別。分別取純硅膠粉末微量以及混懸的脂質(zhì)體-硅膠復(fù)合物 μL 與于檢測(cè)膠條上，真空噴金處理 10 min 后進(jìn)行檢測(cè)，其微觀形態(tài)如圖 2-3 所示。從圖中可以看出，在 20000 倍放大條件下，硅膠表面相對(duì)較為光滑，而復(fù)合物表面能看到有明顯包裹及附著的物質(zhì)，證明脂質(zhì)體確實(shí)包裹于硅膠表面。硅膠及復(fù)合物的表

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本文編號(hào)：2733913