【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以手、腕等小關(guān)節(jié)受累為主的多關(guān)節(jié)疾病,臨床表現(xiàn)為受感染的關(guān)節(jié)紅腫和痛覺過敏,病變持續(xù)且反復(fù)發(fā)作,具有極高的致殘率。目前尚未完全闡明RA的發(fā)病機(jī)制,對臨床上如何有效防治RA提出了巨大挑戰(zhàn),抗炎和鎮(zhèn)疼仍然是防治RA的主要手段�；颊哐逯凶陨砜贵w的發(fā)現(xiàn)逐步揭示RA屬于自身免疫疾病,為其免疫抑制治療提供了理論依據(jù)。自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制主要涉及效應(yīng)記憶T淋巴細(xì)胞(Effector Memory T細(xì)胞,T_(EM)細(xì)胞)的異常激活和增殖,該過程與T_(EM)細(xì)胞膜上電壓門控性鉀通道Kv1.3過高表達(dá)密切相關(guān),藥物阻斷或基因敲除Kv1.3后,對RA模型動(dòng)物表現(xiàn)出較強(qiáng)的治療作用,提示Kv1.3是發(fā)現(xiàn)特異性RA免疫抑制治療藥物的新靶點(diǎn)。RA患者主要臨床癥狀之一表現(xiàn)為患病關(guān)節(jié)劇烈疼痛,緩解RA患者的關(guān)節(jié)疼痛癥狀能夠顯著改善RA患者生活質(zhì)量。嗎啡類藥物鎮(zhèn)痛效果顯著,但具有成癮性的毒副作用。開發(fā)能顯著改善RA患者臨床癥狀的非成癮性鎮(zhèn)疼藥物十分必要。哺乳動(dòng)物初級感覺神經(jīng)元細(xì)胞膜上表達(dá)有多種類型電壓門控性鈉通道,其中河豚毒素敏感性(Tetrodotoxin sensitive,TTX-S)鈉通道是開發(fā)非成癮性鎮(zhèn)疼藥物的重要靶蛋白。顯然,活性物質(zhì)倘能同時(shí)阻斷Kv1.3和TTX-S鈉通道,則能產(chǎn)生免疫抑制和鎮(zhèn)疼的雙重藥理作用,從而有望成為開發(fā)防治RA藥物的優(yōu)良先導(dǎo)化合物。課題組前期的研究表明查耳酮類化合物龍血素B(Loureirin B,LrB)能夠阻斷哺乳動(dòng)物初級感覺神經(jīng)元上TTX-S鈉通道,從而產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)疼效應(yīng),并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LrB能夠抑制哺乳動(dòng)物外源性和內(nèi)源性Kv1.3通道。前期的研究提示LrB極可能對RA產(chǎn)生良好的防治效果,為此,本研究擬人工合成LrB,為增加LrB的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,本研究同時(shí)也合成了LrB的乙�；a(chǎn)物(Acetylized Loureirin B,AcLrB),擬系統(tǒng)研究合成的LrB和AcLrB對RA大鼠的治療作用,深入探討二者防治RA的細(xì)胞與分子機(jī)制。在本課題研究的第一部分(第二章),采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測了合成的LrB和AcLrB對Kv1.3通道的調(diào)節(jié)作用。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,合成的LrB能夠濃度依賴性阻斷外源性表達(dá)在HEK-293T細(xì)胞膜上Kv1.3通道電流,其阻斷Kv1.3的最大半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC_(50))為6.33±0.49μM。相比于LrB,AcLrB阻斷Kv1.3的效果更優(yōu),其IC_(50)為2.24±0.15μΜ。此外,AcLrB阻斷Kv1.3通道的選擇性也要強(qiáng)于LrB,對于Kv1.3的同源蛋白Kv1.1和Kv1.2,AcLrB的阻斷效率分別降低了約10倍和100倍。本部分的研究結(jié)果提示人工合成的LrB很好的保持了阻斷Kv1.3通道蛋白的藥理活性,LrB經(jīng)乙�；揎椇蠼Y(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,且阻斷Kv1.3的效率和選擇性均得到一定程度的提高。在本課題研究的第二部分(第三章),仍然采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù),分別檢測合成的LrB、AcLrB對哺乳動(dòng)物痛覺相關(guān)性電壓門控性鈉通道的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明,LrB和AcLrB均能濃度依賴性阻斷小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上TTX-S鈉通道,IC_(50)分別為6.14±0.51μM和13.69±0.56μM。Nav1.7是哺乳動(dòng)物初級感覺神經(jīng)元上主要的TTX-S鈉通道亞型,本研究進(jìn)一步檢測了LrB、AcLrB對外源性表達(dá)在HKE-293T細(xì)胞膜上Nav1.7的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示,LrB和AcLrB對Nav1.7表現(xiàn)出活性相當(dāng)?shù)淖钄嘧饔?IC_(50)分別為3.97±0.08μM和4.35±0.16μM。本部分的研究結(jié)果表明與以往天然提取的LrB活性類似,合成的LrB也能夠高效阻斷哺乳動(dòng)物初級感覺神經(jīng)元上TTX-S鈉通道,LrB經(jīng)乙�；揎椇笕匀槐Ａ袅讼囝愃频拟c通道阻斷活性。本課題的前兩部分研究(第二章、第三章)表明LrB及其乙�；苌顰cLrB均能同時(shí)阻斷Kv1.3和TTX-S鈉通道,強(qiáng)烈提示二者可能具有良好的防治RA藥理作用。在本課題的第三部分,采用牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)制作RA大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,檢測LrB和AcLrB對RA大鼠的防治作用。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,無論是預(yù)防組還是治療組,LrB和AcLrB均能有效的降低RA大鼠行為學(xué)評分,讓患病大鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度緩解并能提高RA大鼠的疼痛閾值。CT檢查顯示,LrB和AcLrB均能有效緩解或一定程度上改善RA大鼠骨關(guān)節(jié)增生病變。HE結(jié)果顯示,LrB和AcLrB均能減少RA大鼠踝關(guān)節(jié)的炎性浸潤,減少踝關(guān)節(jié)滑膜增生及軟骨病變。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明,LrB和AcLrB均能顯著降低藥物治療組RA大鼠血清中的IL-6、IL-1β等炎性細(xì)胞因子的濃度。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測結(jié)果表明LrB和AcLrB均顯著抑制RA大鼠外周血總T細(xì)胞及CD4~+T細(xì)胞亞群增殖。最后采用RT-PCR檢測,結(jié)果表明RA大鼠模型組中外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及鉀通道Kv1.3mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對照組大鼠;與模型組相比,LrB、AcLrB治療組中IL-1β和Kv1.3的mRNA表達(dá)水平顯著降低。本部分研究結(jié)果強(qiáng)烈表明LrB及其乙�；苌顰cLrB均對RA模型大鼠表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)疼和免疫抑制效果。本研究的第四部分(第五章)以植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)激活的Jurkat T細(xì)胞和刀豆球蛋白A(Concanavalin A,ConA)激活的PBMC為細(xì)胞模型,聯(lián)合使用ELISA實(shí)驗(yàn)、RT-PCR檢測和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù),進(jìn)一步探討LrB和AcLrB免疫抑制的細(xì)胞分子機(jī)制,并體外檢測LrB和AcLrB的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對于PHA激活的Jurkat T細(xì)胞,LrB和AcLrB均可以顯著抑制細(xì)胞因子IL-2的釋放,降低Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。對于ConA激活的大鼠PBMC,LrB和AcLrB均可以顯著抑制炎性細(xì)胞因子IL-2和IL-17的釋放,顯著降低Kv1.3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。CCK8試劑盒檢測LrB和AcLrB對大鼠PBMC的毒性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示即使10μM高濃度的LrB和AcLrB也未對大鼠PBMC產(chǎn)生明顯的毒性作用。本部分的研究結(jié)果提示LrB和AcLrB的免疫抑制效應(yīng)可能與它們降低激活的T細(xì)胞Kv1.3表達(dá)水平有關(guān)。綜合以上各部分的研究,本課題揭示了LrB及其乙�；苌顰cLrB一方面直接阻斷T細(xì)胞膜上Kv1.3通道,并能降低激活的T細(xì)胞Kv1.3表達(dá)水平,進(jìn)而抑制T細(xì)胞的激活增殖和炎性細(xì)胞因子釋放,從而有效減弱RA大鼠的自身免疫反應(yīng);另一方面LrB和AcLrB高效阻斷TTX-S鈉通道可能是導(dǎo)致RA大鼠痛覺閾值上升的重要藥理作用。LrB、AcLrB的免疫抑制和鎮(zhèn)疼協(xié)同作用提示其在RA防治中的潛在藥用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

圖 1 T 細(xì)胞在經(jīng)歷靜止期、活化期 Kv1.3 在各 T 細(xì)胞亞型上的分布[23]1.4 龍血竭及其活性單體龍血素 B 的免疫抑制作用龍血竭（RESINA DRACONIS）是從我國云南劍葉龍血樹（Dracaena

29第 4 日-27 日記錄每只大鼠的臨床行為學(xué)評分、足趾腫脹體積和機(jī)械痛閾值，統(tǒng)計(jì)值。A、CIA 大鼠平均臨床評分統(tǒng)計(jì)圖；B、CIA 大鼠平均足趾腫脹體積統(tǒng)計(jì)圖；C、C鼠平均機(jī)械痛覺閾值統(tǒng)計(jì)圖（n=7，mean±SEM，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001）圖 4.1 CIA 大鼠的臨床評分、足趾腫脹體積、機(jī)械痛覺閾值

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2731138