【摘要】：葡萄糖和脂質代謝紊亂,是導致糖尿病和心血管疾病的主要危險因素。當今,糖尿病和心血管疾病已經(jīng)成為全球死亡率最高的疾病。噻唑烷二酮類藥物是目前用于治療糖尿病的經(jīng)典藥物,其可以通過激活PPARγ而有效地調節(jié)糖代謝,但也有導致體重增加、脂質聚積和組織損傷等副作用。而最著名的治療心血管疾病的藥物,他汀類藥物,在有效降低血清中膽固醇水平的同時,也表現(xiàn)出一系列的副作用,如肝損傷、肌肉損傷和高血糖等。因此,開發(fā)新型改善葡萄糖和脂質代謝,并且副作用較小的藥物仍十分迫切,并具有非常好的前景。Sirtuin 1(SIRT1)是一種NAD+依賴的組蛋白去乙�；�,在控制能量代謝,壓力反應、血管保護和衰老方面起著關鍵性作用。Kruppel樣因子2(KLF2)是一種重要的具有鋅指結構的轉錄因子,KLF2通過其在內皮細胞中的抗炎,抗血栓形成,抗氧化以及調節(jié)增殖作用來維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)和正常功能。鑒于SIRT1和KLF2的血管保護作用,調節(jié)SIRT1和KLF2活性或表達可能會成為治療糖尿病和心血管疾病的新策略。然而,目前用于調節(jié)SIRT1或KLF2活性的小分子藥物還鮮有報道。鑒于此,我們進行了靶向SIRT1和KLF2的小分子藥物的篩選、藥理學作用和機制研究。第一部分以SIRT1為靶標的糖脂代謝調節(jié)藥物篩選及分子藥理學研究SIRT1可參與介導熱量限制影響各種生物的代謝和衰老的過程。最近的研究表明,增強SIRT1的活性或表達也可發(fā)揮調節(jié)葡萄糖和脂質代謝的作用。本研究第一部分工作旨在尋找能夠調控葡萄糖和脂質代謝的新型SIRT1小分子激活劑。本室前期利用已建立的SIRT1激活劑高通量篩選模型進行篩選,得到一個新的SIRTI激活劑E6155。E6155是一種哌嗉1,4-二酰胺類化合物,首次被發(fā)現(xiàn)為SIRT1的小分子激活劑。在體外實驗中,化合物E6155以SIRT1依賴的方式降低SIRT1底物p53的乙�；�,證明了化合物E6155的確為SIRT1的激活劑。我們進一步研究發(fā)現(xiàn),化合物E6155通過增加SIRT1去乙酰酶的活性而顯著上調人正常肝細胞和大鼠骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取。在二型糖尿病KKAy小鼠中,化合物E6155可以顯著降低小鼠的空腹血糖水平。同時,化合物E6155可明顯改善二型糖尿病小鼠的口服葡萄糖耐量異常和胰島素耐量異常。葡萄糖鉗夾實驗和HOMA-IR指數(shù)評估顯示化合物E6155可以增強二型糖尿病小鼠的胰島素敏感性,改善胰島素抵抗。機制研究表明,化合物E6155改善胰島素抵抗,調節(jié)葡萄糖代謝的作用涉及到SIRT1依賴的LKB1/AMPK和IRS1/AKT信號通路的激活。這一研究結果確定了化合物E6155是一種新型SIRT1激活劑,并提示其可能成為一種治療胰島素抵抗和糖尿病的藥物候選物。通過高通量篩選,我們還得到另外一個哌嗪1,4-二酰胺類化合物E1231。篩選模型的量效曲線顯示,化合物E1231顯著上調SIRT1的活性,EC50為0.83 μM。前期表面等離子體共振實驗表明,化合物E1231能夠以劑量依賴的方式與重組人SIRT1蛋白相互作用,顯示出較強的親和力。體外實驗顯示化合物E1231以SIRT1依賴的方式顯著降低SIRT1底物p53的乙�；�,而免疫共沉淀實驗證明化合物E1231可以使LXRα發(fā)生去乙酰化,這些都證實化合物E1231的確為SIRT1的激活劑�；衔顴1231可以通過激活SIRT1和LXRα上調小鼠巨噬細胞中與膽固醇代謝相關的ABCA1的表達。體外功能實驗表明化合物E1231通過SIRT1和ABCA1顯著促進細胞內膽固醇的流出并且抑制巨噬細胞中的脂質聚積。在金黃地鼠高膽固醇血癥模型中,化合物E1231可以顯著降低血清和肝臟中總膽固醇和甘油三酯的水平,并增加糞便中的膽固醇含量,參與調節(jié)體內膽固醇逆轉運的過程。機制研究表明,化合物E1231可顯著提高金黃地鼠肝臟中SIRT1和ABCA1蛋白的表達。在ApoE-/-小鼠模型中,化合物E1231可顯著減少小鼠主動脈和心臟流出道動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生。通過這一研究確定了化合物E1231是一個新型的SIRT1激活劑并闡明了其對脂質和膽固醇代謝的有益作用。第二部分以KLF2為靶標的脂代謝調節(jié)藥物篩選及分子藥理學研究轉錄因子Kruppel樣因子2(KLF2)是血管內皮中一種重要的抗炎和抗動脈粥樣硬化的血管保護分子。增強KLF2的活性或表達可以改善內皮功能并預防動脈粥樣硬化的發(fā)生。在本研究的第二部分,我們構建了基于KLF2啟動子螢光素酶報告基因檢測的高通量篩選模型,通過篩選以期得到新型KLF2激活劑。通過對化合物庫(美國羅切斯特大學)中的2 400個化合物進行篩選,我們確定了一個被美國FDA批準為有效抗癌藥物的HDAC抑制劑SAHA為有效的KLF2激活劑。我們通過體外研究發(fā)現(xiàn)SAHA表現(xiàn)出較強的抗炎作用并可顯著抑制TNFα誘導的單核細胞與內皮細胞的粘附。通過分離KLF2缺陷小鼠的肺內皮細胞及使用KLF2 siRNA,進一步研究表明SAHA對內皮炎癥以及單核細胞粘附的抑制作用依賴于其上調KLF2的活性。確定了 SAHA的體外抗炎作用后,我們進一步采用ApoE-/-小鼠模型,SAHA口服灌胃給藥,以評估其抗動脈粥樣硬化的作用。結果發(fā)現(xiàn),SAHA可顯著降低高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的病變發(fā)展,而對其血脂水平?jīng)]有顯著影響。這些結果表明,SAHA在內皮細胞中具有KLF2依賴性的抗炎作用,提示SAHA可能成為動脈粥樣硬化的有效治療藥物。通過KLF2激活劑高通量篩選模型,我們還獲得了一個多酚類化合物Tannic Acid(TA)。研究表明TA通過作用于ERK5/MEF2信號通路來上調內皮細胞中KLF2的表達。功能研究顯示,TA通過降低粘附分子VCAM1的表達而顯著降低單核細胞與內皮細胞的粘附。使用從KLF2缺陷小鼠體內分離的肺內皮細胞,我們發(fā)現(xiàn)TA的抗炎作用依賴于對KLF2表達的上調。研究結果表明,TA是一種有效的KLF2激活劑,可以通過上調KLF2的表達而抑制內皮炎癥。同時我們的研究結果還為TA已確定的心血管保護作用提供了一種新的機制解釋,并為激活KLF2可能是動脈粥樣硬化等心血管疾病有希望的治療策略提供了理論支持。綜上所述,通過使用基于SIRT1和KLF2的高通量篩選模型,我們發(fā)現(xiàn)了一系列新型SIRT1和KLF2激活劑。我們的結果闡明了 SIRT1和KLF2激活劑對調節(jié)葡萄糖和脂質代謝的有益作用,并且揭示它們可能成為治療糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝綜合征的新型藥物。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96
【圖文】：

圖２．活性化合物Ｅ６１５５的ＳＩＲＩＴ激活活性驗證逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｅ６１５５邋ａｓ邋ａ邋ＳＩＲＴ１邋ａｃｔｉｖａｔｏｒ．邋（Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ逡逑ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ａｃ－ｐ５３邋ａｎｄ邋ｔｏｔａｌ邋ｐ５３邋ｏｆ邋ｗｈｏｌｅ邋ＨｅｐＧ２邋ｃｅｌｌ邋ｌｙｓａｔｅｓ．邋Ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｃｕｂａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，邋ａｎｄ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｅ６１５５邋ｏｒ邋ＥＸ５２７邋ａｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ．邋Ｂｌｏｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｏｂｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ａｃ－ｐ５３，邋ｐ５３邋ａｎｄ邋ＧＡＰＤＨ．邋（Ｂ）邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｐａｎｅｌ邋Ａ，邋ｖａｌｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋±ＳＥＭ，Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋（Ｔｕｋｅｙ’ｓ邋ｍｕｌｔｉｐｌｅ逡逑ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ邋ｔｅｓｔ），邋＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ邋＜０．０１，邋ｎ＝４．逡逑１．３活性化合物Ｅ６１５５體外調節(jié)葡萄糖攝取測定逡逑根據(jù)文獻報道，提高ＳＩＲＴ１的活性能夠顯著改善血糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性［３７】，逡逑而葡萄糖攝取和利用則對體內葡荀糖穩(wěn)態(tài)的保持起著關鍵性作用。因此，我們在逡逑正常人肝Ｌ０２細胞系和大鼠骨骼�。蹋都毎抵�，評價了化合物對葡萄糖攝取的調節(jié)逡逑作用。逡逑首先，在Ｌ０２細胞系中，化合物Ｅ６１５５在０．１邋ｐＭ濃度時可顯著提高細胞的葡萄逡逑

北京協(xié)和醫(yī)學院博士學位論文邐第一部分實驗結果逡逑同時，本研宄也測定了化合物Ｅ６１５５在大鼠骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取活性。逡逑以含２％邋ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培養(yǎng)基培養(yǎng)７天后，Ｌ６細胞可分化形成骨骼肌細胞。與Ｌ０２細逡逑胞中結果類似，化合物Ｅ６１５５處理后，Ｌ６骨骼肌細胞的葡萄糖攝取水平顯著升高，逡逑此外化合物Ｅ６１５５介導的上調葡萄糖攝取水平的活性可被ＳＩＲＴ１特異性抑制劑逡逑ＥＸ５２７顯著逆轉（Ｆｉｇｕｒｅ邋３Ｂ）。逡逑

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