【摘要】：肝纖維化發(fā)生時活化的肝星狀細胞(HSCs)快速擴增并合成大量細胞外基質(zhì)蛋白(ECM)和組織金屬蛋白酶抑制劑,造成ECM蛋白在肝組織內(nèi)過度沉積,從而引起纖維化。各類抗纖維化藥物在臨床使用上都面臨療效低下、毒副作用大的困境,而增強藥物對纖維化肝組織和活化HSCs的靶向性是解決這些問題的關(guān)鍵。干擾素γ(IFNγ)可顯著抑制成纖維細胞的增殖和降低膠原蛋白的產(chǎn)生,但其過短的半衰期和嚴重的系統(tǒng)性副作用限制了其在臨床上的應(yīng)用。鑒于肝纖維化疾病病人組織中I型膠原的異常沉積和人胎盤生長因子2氨基酸123-144肽段(PIGF-2_(123-144))對I型膠原蛋白出眾的高親性,本研究將PIGF-2_(123-144)片段用于對IFNγ改性,增加其對纖維化肝臟的靶向性和在病變部位的滯留;進一步以特異性識別活化HSCs表面高表達的PDGFβ受體的雙環(huán)PDGFβ受體結(jié)合肽(BiPPB)取代IFNγ的受體識別功能區(qū),賦予其對活化HSCs的靶向性、避免其非特異性作用活性。本研究首次將PIGF-2_(123-144)與BiPPB-mim IFNγ多肽融合,獲得了既具備同Ⅰ型膠原蛋白高親和性結(jié)合進而靶向纖維化肝臟的、又可特異性作用于活化肝星狀細胞的IFNγ重組蛋白。首先對人PIGF-2_(123-144)的編碼DNA序列進行修改、構(gòu)建了GST-PIGF-2_(123-144)融合蛋白的原核表達質(zhì)粒,大量表達、親和純化后通過ELISA實驗確定了該原核表達的GST-PIGF-2_(123-144)融合蛋白具備和I型膠原蛋白高親性結(jié)合。然后通過原核細胞表達了PIGF-2_(123-144)與BiPPB通過3個甘氨酸或6個甘氨酸連接的GST-PIGF-2_(123-144)-BiPPB融合蛋白,純化后的兩種融合蛋白均保留了PIGF-2_(123-144)對I型膠原蛋白的高親合結(jié)合性。接著表達純化了GST-mim IFNγ和GST-BiPPB-mimIFNγ蛋白,作用于活化HSC-T6細胞,在摩爾數(shù)相同情況下GST-BiPPB-mim IFNγ較GST-mim IFNγ更加明顯地抑制了MF表型分子標記基因的表達。最后,構(gòu)建了GST-PIGF-2_(123-144)-BiPPB-mimIFNγ表達質(zhì)粒,經(jīng)原核細胞表達和親和純化后,GST-PIGF-2_(123-144)-BiPPB-mim IFNγ蛋白具有良好的Ⅰ型膠原蛋白親和結(jié)合性,可顯著下調(diào)MF表型分子標記基因水平,并明顯降低細胞中Ⅰ型膠原蛋白的產(chǎn)生。本文改造的IFNγ重組蛋白特異性強、分子量小、易于制備,特別是具備對纖維化肝臟和活化肝星狀細胞的雙重靶向性。
【學位授予單位】：西南交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R96
【圖文】：

西南交通大學碩士研究生學位論文 第 5 頁要高出許多，大量查閱文獻后發(fā)現(xiàn)雙環(huán) PDGFβ 受體結(jié)合肽（ bicyclGFbR-recognizing peptide，BiPPB）可以很好地介導與其偶聯(lián)的納米粒子或者細胞因活化態(tài) HSCs 攝取，進而減輕藥物的毒副作用。但仍然避免不了體循環(huán)時對其他器官的影響，并且在纖維化肝臟內(nèi)的有效藥物濃度也有待提高，這引起了我們進的思考與探索[67-69]。

課題設(shè)計技術(shù)路線

【參考文獻】

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本文編號：2728547