【摘要】：Kallistatin(KAL)是一種多功能蛋白,具有抗氧化應(yīng)激、抗血管生成、抗纖維化、抗腫瘤等多種活性。本實驗室前期運用酵母工程菌發(fā)酵并制得其重組蛋白,用于制備其單克隆抗體時發(fā)現(xiàn)效價不高,分析可能由于酵母菌表達重組KAL蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生變化而致。于是本文主要構(gòu)建CHO-K1細胞高表達載體,并篩選高表達KAL蛋白的穩(wěn)定株,懸浮無血清馴化后,批量表達純化得到KAL蛋白并探索其對肝癌的作用。本文主要的研究方法和研究結(jié)果如下:首先運用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含有Kozak序列,人白蛋白信號肽與人工設(shè)計的信號肽,穿膜肽TAT與pcDNA3.1、pTT5、pMH3、pMH3EN載體相連的18種載體。用PEI瞬時轉(zhuǎn)染,雙抗夾心ELISA檢測,選取KAL表達量最高的載體,運用優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞,轉(zhuǎn)染后36 h,消化轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中,用篩選濃度G418來篩選,挑取單菌落接種到96孔細胞培養(yǎng)板中,G418繼續(xù)篩選。7天后ELISA檢測細胞上清KAL含量,選取陽性值高(A≥1.0),有限稀釋法克隆化。經(jīng)三次克隆化后,逐漸擴大培養(yǎng)置100 mm細胞培養(yǎng)皿中,成功篩得表達KAL的穩(wěn)定株。然后懸浮無血清馴化后,批量表達優(yōu)化,Ni柱純化得到KAL蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鑒定之。最后用CCK-8和Hoechst 33342染色以及Transwell實驗分別檢測KAL對肝癌細胞的作用,并用Western blot初步驗證KAL對肝癌的可能原因。本研究表明:(1)不同信號肽,穿膜肽對蛋白的分泌表達效果不盡相同,其中本研究使用的一種人工設(shè)計的信號肽對KAL的表達量在不同載體都有顯著提高。本研究構(gòu)建的最佳載體是未優(yōu)化載體的KAL表達量的10倍。(2)運用G418篩選,三次克隆化后成功篩選出表達KAL的CHO-K1的4株穩(wěn)定株——2F8、4B4、4E7和7D11。懸浮無血清馴化后,繼續(xù)加維持劑量的G418和采用分次流加培養(yǎng)的方法,10天時培養(yǎng)基中KAL蛋白濃度最高為11mg/L。批量表達Ni柱純化CHO細胞表達的KAL重組蛋白分子量為60 kD左右,比大腸桿菌(40 kD)和酵母(58 kD)表達的要略大。主要因為CHO細胞翻譯后修飾以及有His標簽。(3)研究發(fā)現(xiàn)KAL能抑制肝癌細胞的生長增殖,Tranwell實驗表明KAL可抑制其遷移和侵襲。Hoechst33343染色發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡,其誘導(dǎo)肝癌凋亡的具體機制有待進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

CKN和TKN載體的構(gòu)建Figure2.3ConstructingthevectorofCKNand..TKN(a)目的片段KAL的PCR合成和切膠回收片段，M:DL2000DNA.Maiker;1,2為PCR回收;3,4為PCR原液

for aminoacids in protein），運用 PCR 在 KAL 的 CDS 啟動子前加 Kozak 序列，經(jīng) TA 克隆到 pMD19-T 載體上，菌落 PCR 后陽性送測序，與設(shè)計后的片段序列相匹配，經(jīng) EcoRI 與 NotI 雙酶切后連接到相同雙酶切后的 pcDNA3.1 和 pTT5 載體上，轉(zhuǎn)化 TOP10 感受態(tài)細胞，測序 BLAST 后與預(yù)計結(jié)果相符。得到的質(zhì)粒CKN 雙酶切一條載體條帶 5400 bp 左右，一條為目的基因片段條帶 1300 bp 左右。得到的質(zhì)粒 TKN 雙酶切一條載體條帶 4200 bp 左右，一條為目的基因片段條帶 1300 bp 左右。2.3.2 高表達載體構(gòu)建鑒定構(gòu)建不同信號肽與含 TAT 的載體具體同上，本處主要先將穿膜肽 TAT 與His 標簽通過普通 PCR 連接到 KAL 成熟肽 CDS 片段上，即得到一條 KAL 成熟肽 CDS 與 6×His 的片段與一條 KAL 成熟肽 CDS 與 TAT-His 標簽的片段，然后重疊延伸 PCR 連接到人白蛋白信號肽與人工合成的信號肽，由此得到 四條不同的片段。經(jīng) EcoRI 與 NotI 雙酶切連接到 pcDNA3.1 載體上后，測序正確，再經(jīng)相應(yīng)雙酶切連接到 pTT5，pMH3 和 pMH3EN 載體上。

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;中西醫(yī)結(jié)合肝癌治療技術(shù)新進展學(xué)術(shù)研討會會議征文通知[J];世界中西醫(yī)結(jié)合雜志;2017年01期

2 劉波;羅強;王洪林;;射頻消融在肝癌治療中的應(yīng)用進展[J];河北醫(yī)藥;2017年06期

3 任志忠;張躍偉;;磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝癌治療中的應(yīng)用進展[J];臨床肝膽病雜志;2017年07期

4 袁筑慧;王洋;鄭加生;李威;;肝癌治療療效影像學(xué)評價標準研究現(xiàn)狀與進展[J];北京醫(yī)學(xué);2017年09期

5 湯釗猷;;肝癌治療的“消滅與改造并舉”策略[J];實用肝臟病雜志;2015年02期

6 滕皋軍;;如何正確看待“小蘇打治肝癌”?[J];祝您健康;2017年03期

7 楊秀琴;盛艷;;肝動脈化療栓塞術(shù)在肝癌治療中的應(yīng)用與價值研究[J];人人健康;2017年16期

8 鄒靜懷;任正剛;;對付肝癌:戰(zhàn)術(shù)多樣 戰(zhàn)略有度[J];益壽寶典;2017年29期

9 韓晶晶;于英君;;重組基因藥物在肝癌治療方面的研究進展[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2014年16期

10 韓晶晶;于英君;;重組基因藥物在肝癌治療方面的研究進展[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2014年16期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 薛峰;王伯慶;尹繼煒;易超;;手術(shù)切除與微波消融對小肝癌治療效果的比較研究[A];中國中藥雜志2015/專集：基層醫(yī)療機構(gòu)從業(yè)人員科技論文寫作培訓(xùn)會議論文集[C];2016年

2 彭寶崗;;肝癌治療進展[A];第一屆廣東省肝癌綜合治療高峰論壇暨廣東省肝臟病學(xué)會綜合治療專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2013年

3 牟培源;董寶瑋;梁萍;于曉玲;于德江;蘇莉;張晶;;高聚生肝內(nèi)注射在肝癌治療中的臨床應(yīng)用價值[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

4 楊秉輝;;肝癌治療方法的選擇[A];第八屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

5 張一心;汪曉鶯;陳拓;王慶慶;尤其邑;;IL-2刺激的IL-12升高在晚期肝癌治療中的研究[A];第八屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

6 鄭樹森;;肝癌治療的現(xiàn)狀和趨勢[A];2005年浙江省外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

7 樓孝惠;王際云;張敏娜;;中西醫(yī)結(jié)合治療原發(fā)性肝癌概述[A];2011年長江三角洲中醫(yī)肝病協(xié)作組學(xué)術(shù)會議暨浙江省中醫(yī)藥學(xué)會肝病分會學(xué)術(shù)年會文集[C];2011年

8 陳世f^;;射頻消融術(shù)在肝癌治療中的臨床應(yīng)用[A];2010湖北省腫瘤介入治療學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2010年

9 趙伏義;李飛波;倪之嘉;傅志仁;王振興;;肝內(nèi)復(fù)發(fā)性肝癌治療結(jié)果分析[A];2005年浙江省外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

10 于麗紅;孫艷麗;;一氧化氮合酶肝癌治療中變化趨勢的分析[A];第三屆全國臨床檢驗實驗室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 通訊員 金曉璐;肝癌早診早治、預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移獲重大技術(shù)創(chuàng)新[N];家庭醫(yī)生報;2018年

2 方序;揭示肝癌的生存之道[N];健康報;2018年

3 本報記者 譚嘉;肝癌治療要強化整體意識[N];健康報;2018年

4 記者 王瀟雨;新型納米粒子“黏合”兩療法抗肝癌[N];健康報;2017年

5 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院腫瘤微創(chuàng)介入中心主任 鄭加生;微創(chuàng)消融成肝癌治療趨勢[N];健康報;2016年

6 ;肝癌治療 中醫(yī)如何發(fā)揮優(yōu)勢[N];健康報;2012年

7 新;肝癌治療有新法[N];廣東科技報;2002年

8 山西中醫(yī)學(xué)院 李朝喧　北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 董青;崔應(yīng)珉肝癌治療思路[N];中國中醫(yī)藥報;2009年

9 本報記者 王彩歷;肝癌治療急需規(guī)范[N];衛(wèi)生與生活報;2009年

10 劉濤;中南大學(xué)肝癌治療研究獲重大成果[N];中國醫(yī)藥報;2001年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙泉;～（125）Ⅰ粒子組織間植入治療肝癌的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

2 包國強;利用導(dǎo)向選擇及噬菌體抗體庫技術(shù)制備人源性抗肝癌抗體[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 司少艷;肝癌靶向調(diào)控SEA-CD80基因共表達腺病毒載體的構(gòu)建及抗癌免疫效應(yīng)的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 鮑世韻;卡鉑碳包鐵納米籠殼聚糖微球靶向治療肝癌的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2006年

5 韓蘇夏;SP-TAT-VP3融合基因表達對肝癌治療作用的實驗研究[D];西北大學(xué);2008年

6 王軍;肝癌治療的循證研究[D];蘭州大學(xué);2012年

7 張清淋;負載表阿霉素的聚乙二醇—聚谷氨酸膠束在肝癌治療中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2015年

8 陳麗;表沒食子兒茶素沒食子酸酯在肝癌治療中的自噬藥理學(xué)機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2012年

9 王華茂;抗EGFRvⅢ單克隆抗體制備及其在肝癌治療中的應(yīng)用[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

10 馬瑞花;逆轉(zhuǎn)糖酵解—基于糖代謝的肝癌治療新策略研究[D];華中科技大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊夏威;手術(shù)切緣對單發(fā)肝癌伴微血管侵犯患者預(yù)后的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 任遠;負載CD133+肝癌細胞RNA樹突狀細胞疫苗活化的CTL抗肝癌研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

3 桂陽;溶酶體相關(guān)膜蛋白3在肝癌中的表達及其臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

4 袁丁玲;氬氦刀與CTPI結(jié)合治療肝癌[D];河北工程大學(xué);2018年

5 劉鶴男;DEB-TACE與cTACE對中晚期肝癌的療效對比[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

6 汪湄;AZT協(xié)同As_2O_3通過AQP9拮抗肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2018年

7 騰橋;以GPC3為靶點的納米抗體的制備及對肝癌細胞的靶向識別效應(yīng)初探[D];新疆大學(xué);2018年

8 高三星;人Kallistatin重組蛋白在CHO細胞中表達及其抗肝癌功能探索[D];華僑大學(xué);2018年

9 楊振杰;中藥復(fù)方肝癌1號對肝癌細胞抗腫瘤作用的實驗研究[D];青島大學(xué);2018年

10 傅奎;RIP140在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及其臨床意義[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2728301