【摘要】：目的：Apelin為G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附等作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，apelin-13可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，且PI3K-Akt-ERk1/2-p70S6K信號(hào)途徑和PI3K-自噬途徑均介導(dǎo)了apelin-13誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程。本課題擬研究apelin-13對(duì)NOX4的表達(dá)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，并在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討apelin-13誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬機(jī)制，揭示apelin-13誘導(dǎo)心肌肥厚的新的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)APJ為心血管藥物作用靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。 方法: 1. Western Blot：檢測(cè)大鼠H9c2心肌細(xì)胞APJ, Bip, CHOP, LC3-II/I, beclin-1, p62,NOX4, β-Tubulin的表達(dá)； 2. SiRNA干擾: APJ shRNA干擾APJ的表達(dá)；Bip siRNA干擾Bip的表達(dá)；CHOPsiRNA干擾CHOP的表達(dá)； 3.免疫熒光標(biāo)記LC3及氯喹阻斷自噬體的降解，觀察自噬體的形成;或者使用GFP-LC3示蹤觀察自噬體的形成； 4. ER tracker-red熒光標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)； 5. ScepterTM手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器:測(cè)量大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑和體積； 6. BCA定量法：測(cè)定大鼠H9c2心肌細(xì)胞蛋白含量； 7. CCK-8試劑盒檢測(cè)apelin-13對(duì)細(xì)胞增殖的影響； 8. Hoechst33258染色檢測(cè)apelin-13對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響； 結(jié)果： 1. Apelin-13濃度依賴（0-2μM）和時(shí)間依賴性（0-24h）促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)NOX4的表達(dá) 2. Apelin-13濃度依賴（0-2μM）和時(shí)間依賴性（0-24h）促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Bip和CHOP的表達(dá)； 3. APJ shRNA抑制apelin-13（1μM）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Bip和CHOP的增加； 4. Apelin-13誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞自噬體的形成，APJ shRNA抑制apelin-13（1μM）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白beclin1、LC3-II/I的表達(dá)增加； 5. NOX4抑制劑DPI阻斷apelin-13（1μM）誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白Bip和CHOP的增加； 6. NOX4抑制劑DPI阻斷apelin-13（1μM）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白beclin1、LC3-II/I的表達(dá)增加和自噬降解蛋白p62的表達(dá)減少； 7.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal阻斷apelin-13誘導(dǎo)的beclin1和LC3-II/I的表達(dá)增加及p62的表達(dá)降低；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑Tunicamycin對(duì)apelin-13誘導(dǎo)的beclin1和LC3-II/I及p62表達(dá)均無(wú)影響;Bip siRNA和CHOP siRNA阻斷apelin-13誘導(dǎo)的beclin1和LC3-II/I的表達(dá)增加及p62的表達(dá)降低； 8. Apelin-13促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞中GFP-LC3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)，提示可能發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬； 9. APJ shRNA抑制apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加作用；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal阻斷apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加作用；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)劑Tunicamycin增強(qiáng)apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加作用；自噬抑制劑3MA也可以阻斷apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加作用；Bip siRNA和CHOP siRNA同樣具有抑制apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加的作用； 10. Apelin-13濃度依賴性（0-2μM）促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖； 11. Apelin-13濃度依賴（0-2μM）和時(shí)間依賴性（0-24h）增加心肌細(xì)胞凋亡； 12.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal和自噬抑制劑3MA均可阻斷apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡作用；Bip siRNA和CHOP siRNA抑制apelin-13促大鼠H9c2心肌細(xì)胞凋亡作用。 結(jié)論：NOX4-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬途徑介導(dǎo)apelin-13促心肌細(xì)胞肥大和凋亡調(diào)節(jié)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R966
【圖文】：

量的 apelin-13：① Control ②0.001μmol/L ③ 0.01μmol/L ④0.1μmol/L⑤1μmol/L ⑥ 2μmol/L，處理細(xì)胞 24 小時(shí)，western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中 NOX4的表達(dá)。結(jié)果顯示如圖1A：與對(duì)照組比較，給予apelin-13 0.001μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L 和 2μmol/L 均可以促進(jìn)心肌細(xì)胞中 NOX4 的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。按照實(shí)驗(yàn)分組 apelin-13(1μmol/L)分別處理不同時(shí)間：① Control ②3h ③6h ④12h ⑤24h, western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中 NOX4 的表達(dá)。結(jié)果顯示如圖 1B：與對(duì)照組比較，給予 apelin-13 處理細(xì)胞 12h 或者 24h，均可促進(jìn) NOX-4 的表達(dá)。 圖 1 Apelin-13 對(duì) H9c2 心肌細(xì)胞中 NOX4 表達(dá)的量-效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系(x±s,n=3;*p<0.05 vs control)(A:量效關(guān)系; B:時(shí)效關(guān)系)Fig.1 The dose and time effect of apelin-13 on the expression of NOX4 in H9c2 cells.Data are means ± SD of 3 independent experiments.( x ±s, n=3;*p<0.05 vs control) (A

2. Apelin-13 引發(fā)心肌細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激大鼠 H9c2 心肌細(xì)胞用 1% 的 FBS 同步化 24 小時(shí)后，按照實(shí)驗(yàn)分組給予同劑量的 apelin-13：① Control ②0.001μmol/L ③ 0.01μmol/L ④0.1μmol/L1μmol/L ⑥ 2μmol/L，處理細(xì)胞 24 小時(shí)，western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激相關(guān)蛋白 Bip 和 CHOP 的表達(dá)的變化。結(jié)果如圖 2A 所示，apelin-13 0.1μmol/L 及以上濃度時(shí)開(kāi)始促進(jìn)心肌細(xì)胞中 Bip 的表達(dá)，在 1μmol/L 及以上度時(shí)開(kāi)始促進(jìn) CHOP 的表達(dá)。其中以 1μmol/L 時(shí)對(duì) Bip 和 CHOP 的表達(dá)增加為明顯。按照實(shí)驗(yàn)分組 apelin-13(1μmol/L)分別處理不同時(shí)間：① Control ②3h 6h ④12h ⑤24h, western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 Bip 和 CH的表達(dá)的變化。結(jié)果如圖 2B 所示，apelin-13 時(shí)間依賴性的促進(jìn)心肌細(xì)胞中 B和 CHOP 的表達(dá)，從 6 小時(shí)起開(kāi)始具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在 24 小時(shí)的時(shí)候表達(dá)明顯。這些結(jié)果表明 apelin-13 能夠引發(fā)心肌細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2728016