發(fā)布時(shí)間：2020-06-22 16:55

【摘要】：近年來,大量研究表明腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與多種急慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)、帕金森病(Parkinson's disease,PD)和多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)等。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫活性細(xì)胞,在神經(jīng)炎癥中起到了關(guān)鍵性的作用。正常情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)靜息狀態(tài);當(dāng)大腦遭受損傷或感染時(shí),可迅速被激活發(fā)生形態(tài)和功能的改變以發(fā)揮防御修復(fù)的作用,如活化、吞噬、遷移以及釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子比如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等,引發(fā)炎癥反應(yīng)。該炎癥反應(yīng)不僅針對(duì)病變區(qū)的病原體和組織碎片,也會(huì)對(duì)周圍神經(jīng)元造成傷害,引起大腦繼發(fā)損傷。因此,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化對(duì)修復(fù)大腦炎癥損傷的意義顯得尤為重要。Ca~(2+)是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的第二信使,它調(diào)控著多項(xiàng)生命活動(dòng),如細(xì)胞增殖,基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答以及神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等。在免疫系統(tǒng)中,鈣信號(hào)對(duì)淋巴細(xì)胞免疫功能的激活起著重要的調(diào)節(jié)作用。鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流(store operated calcium entry,SOCE)是非興奮細(xì)胞中胞外Ca~(2+)進(jìn)入細(xì)胞最主要的方式,同時(shí)它在cAMP的產(chǎn)生、T淋巴細(xì)胞活化過程中發(fā)揮重要作用。在淋巴細(xì)胞中,SOCE是胞內(nèi)Ca~(2+)增加的主要途徑,用來激活細(xì)胞因子的表達(dá)以及T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化。有研究報(bào)道,SOCE對(duì)UDP(二磷酸尿苷)和LPS(細(xì)菌脂多糖)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用和炎性因子的釋放起重要的調(diào)控作用。SOCE的激活需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白STIM1(基質(zhì)相互作用分子1)和質(zhì)膜上的Ca~(2+)釋放激活的鈣通道蛋白Orais(其同系物有Orai1,Orai2和Orai3)或瞬時(shí)受體電位通道(TRPC)相互作用。AnCoA4,Orai1的特異性抑制劑,藥理學(xué)研究指出其能與Orai1蛋白的C端相結(jié)合,直接抑制在此鈣通道發(fā)生的鈣內(nèi)流,并且能減少Orai1與STIM1的結(jié)合,抑制SOCE。盡管SOCE在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用已經(jīng)被證實(shí),但引起SOCE的原因復(fù)雜,小膠質(zhì)細(xì)胞激活過程中,SOCE發(fā)揮作用的分子機(jī)制目前尚不清楚。為了探究SOCE在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活過程中是否與Orai1蛋白有關(guān),如若有關(guān),Orai1在此過程中究竟發(fā)揮了何種作用,本實(shí)驗(yàn)利用小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2和大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞,通過使用Orai1的特異性抑制劑AnCoA4,借助酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、鈣成像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)手段來探索Orai1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。結(jié)果表明,Orai1的特異型抑制劑AnCoA4在體外培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞和BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),既能在形態(tài)上抑制其活化,使活化態(tài)細(xì)胞減少,又能在功能上產(chǎn)生抑制作用,減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生,減少TNF-α、NO和IL-1β等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。此外,AnCoA4對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞的增殖和原代小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡均有一定的抑制作用。鈣成像結(jié)果還表明,在Tg誘導(dǎo)下,小膠質(zhì)細(xì)胞確實(shí)存在SOCE且Orai1參與了SOCE的過程,但除了Orai1可能還有其他鈣通道和相關(guān)蛋白的參與,比如TRPC通道、Orai1的同系物Orai2,Orai3等。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本次研究得出的結(jié)論是:抑制Orai1可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化,減輕炎癥反應(yīng),并在一定程度上抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡。這為進(jìn)一步探索小膠質(zhì)細(xì)胞中STIM1和Orai1介導(dǎo)的SOCE提供了新的線索,并為因鈣超載引起的小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化進(jìn)而導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的深入研究提供了新的可行性依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié)果1.原代小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定純化的小膠質(zhì)細(xì)胞接種 2~3 天后，待細(xì)胞在蓋玻片上伸出偽足時(shí)，自培養(yǎng)箱中取出做免疫熒光鑒定并計(jì)算其純度。一抗使用 Iba1，二抗使用 CY3，DAPI 染核，在共聚焦顯微鏡（40×）下觀察，結(jié)果如下（圖 1）：

圖 3 不同濃度的 AnCoA4 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響當(dāng) AnCoA4 濃度分別為 5 μM，10 μM，20 μM，50 μM，100 μM 時(shí)，BV-2胞的活性與對(duì)照組相比無顯著差異（P 㧐0. 05）。3.AnCoA4 抑制 LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化小膠質(zhì)細(xì)胞靜息狀態(tài)下呈桿狀或分枝狀，細(xì)胞胞體較小，突起細(xì)LPS 刺激后被激活，形態(tài)發(fā)生改變，變成圓形或阿米巴樣[17]。為了探究能否抑制 LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化而導(dǎo)致的形態(tài)上的改變，我們做胞形態(tài)學(xué)觀察（圖 3）。

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