發(fā)布時(shí)間：2020-06-22 14:56

【摘要】：在臨床治療中,癌癥嚴(yán)重影響著人類的生命健康,臨床上的化療藥物對(duì)正常細(xì)胞具有毒副作用。抗癌肽以其廣譜性、速效性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而受到人們的廣泛重視。本課題以前期工作獲得的chensinin-1b為母肽,但其對(duì)MCF-7癌細(xì)胞的殺傷作用較低,因此利用不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸對(duì)其序列中第17位賴氨酸殘基進(jìn)行修飾,從而設(shè)計(jì)得到具有不同疏水性的類似物,并對(duì)其抗癌活性和機(jī)制進(jìn)行研究。首先,通過(guò)CCK-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)chensinin-1b脂肽的抗癌活性顯著增強(qiáng),且相比于MCF-10A細(xì)胞,對(duì)MCF-7細(xì)胞有一定的選擇性,chensinin-1b、OA-C1b、LA-C1b和PA-C1b的IC_(50)分別為:115.8±3.1μM、59.09±10.11μM、46.09±3.82μM、30.95±1.84μM。通過(guò)RP-HPLC分析脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度的增加能夠增強(qiáng)chensinin-1b脂肽的疏水性,并且其抗癌活性也逐漸增強(qiáng),這說(shuō)明抗腫瘤活性與多肽的疏水性密切相關(guān)。通過(guò)Annexin V-FITC/PI實(shí)驗(yàn)、臺(tái)盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)、MCF-7細(xì)胞對(duì)多肽的攝取實(shí)驗(yàn)來(lái)探究chensini-1b脂肽對(duì)MCF-7細(xì)胞的抗癌機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,chensinin-1b脂肽無(wú)明顯誘導(dǎo)Annexin V-FITC單陽(yáng)性。同時(shí),chensinin-1b、OA-C1b、LA-C1b和PA-C1b均能夠被MCF-7細(xì)胞攝取并對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的完整性有影響,說(shuō)明chensinin-1b系列脂肽殺死人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的機(jī)理是與細(xì)胞質(zhì)膜的相互作用有關(guān)。為了研究chensini-1b脂肽抗癌的膜活性分子機(jī)制,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞對(duì)PI的攝取情況,結(jié)果表明OA-C1b、LA-C1b和PA-C1b均能夠增強(qiáng)PI的攝取量,從而說(shuō)明OA-C1b、LA-C1b和PA-C1b能夠增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)膜的通透性。通過(guò)掃描電子顯微鏡的方法對(duì)PA-C1b處理的MCF-7細(xì)胞質(zhì)膜表面形貌進(jìn)行成像,結(jié)果表明PA-C1b使MCF-7細(xì)胞質(zhì)膜表面完整性被破壞、細(xì)胞質(zhì)膜表面出現(xiàn)孔洞、細(xì)胞質(zhì)膜崩解等特征。利用磷脂模擬腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜、真核細(xì)胞質(zhì)膜的方法,通過(guò)色氨酸藍(lán)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)chensinin-1b、OA-C1b、LA-C1b和PA-C1b與脂質(zhì)體的相互作用,結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)說(shuō)明chensinin-1b脂肽對(duì)癌細(xì)胞膜具有一定的選擇性。通過(guò)裸鼠荷瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究PA-C1b的體內(nèi)抗腫瘤活性,給荷瘤小鼠定期注射PA-C1b,觀察記錄PA-C1b對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制情況。結(jié)果表明,PA-C1b對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用,PA-C1b具有體內(nèi)抗腫瘤活性。最后,通過(guò)構(gòu)建MSNs-NH_2@Cy7-PA-C1b@FA-GO納米靶向藥物遞送系統(tǒng)以提高chensinin-1b系列脂肽的穩(wěn)定性和靶向性。使用葉酸作為腫瘤靶向表分子,使用氧化石墨烯作為藥物遞送系統(tǒng)刺激-響應(yīng)控釋的“分子開(kāi)關(guān)”。結(jié)果表明,MSNs-NH_2@Cy7-PA-C1b@FA-GO能夠被腫瘤細(xì)胞攝取,且在808 nm的近紅外照射下,Cy-7-PA-C1b能夠被控制釋放,在小鼠活體成像中具有一定的體內(nèi)靶向性。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943;R96
【圖文】：

chensinin-1b 脂肽對(duì) MCF-7 細(xì)胞作用機(jī)理的研究及其腫瘤靶向刺激-響應(yīng)納米藥物遞送系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用中，會(huì)激活共同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的受體�？拱╇目梢酝ㄟ^(guò)包括破壞線粒體膜的同時(shí)上調(diào)死亡受體途徑（death receptor pathway），速普肽（tachyplesin）共軛整合素 RGD 通過(guò)此途徑，包括凋亡基因配體（Fas ligand）、死亡域蛋白（floationg Point Addition，F(xiàn)ADD）和 caspase-8[34,35]。1.1.3.2 抗癌肽的非細(xì)胞膜破壞作用機(jī)理非細(xì)胞質(zhì)膜破壞機(jī)制也是抗癌肽抗腫瘤活性作用機(jī)制之一，包括靶向腫瘤細(xì)胞基因，與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)等作用機(jī)制。在研究中，蜂毒肽（millitin），含有 26 個(gè)氨基酸多肽，能夠特異性導(dǎo)致細(xì)胞選擇性的破壞[36]，mellitin 能夠特異性的作用于 R 按時(shí)致癌基因過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞上，使其磷脂酶 A2 被激活致使細(xì)胞選擇性死亡。在近期的研究中還發(fā)現(xiàn) alloferon 1 和 alloferon-2 具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)[37]。通過(guò)對(duì)抗癌肽抗腫瘤細(xì)胞作用機(jī)理的研究，對(duì)抗癌肽的進(jìn)一步研究和發(fā)展打下理論基礎(chǔ)。

圖 1.3 兩親性多肽的結(jié)構(gòu)模型[65]Figure 1.3 Stucture model of amphiphile peptides[65]2 通過(guò)構(gòu)建無(wú)機(jī)納米載體提高多肽藥物穩(wěn)定性通過(guò)使用生物相容性好和體內(nèi)穩(wěn)定的介孔二氧化硅等材料，裝載多肽藥物，可多肽藥物的保護(hù)。介孔二氧化硅藥物遞送系統(tǒng)在提高多肽穩(wěn)定性的同時(shí)可以被物大分子實(shí)現(xiàn)修飾。 腫瘤微環(huán)境與腫瘤靶向藥1 腫瘤微環(huán)境腫瘤微環(huán)境 (tumor microenvironment，TME) 即腫瘤所處的內(nèi)環(huán)境。腫瘤微環(huán)功能單元，其生物學(xué)功能貫穿腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TME 的三大特征是缺氧，疫抑制[87]。缺氧信號(hào)出現(xiàn)在多種免疫抑制途徑中，腸道菌群 - 慢性炎癥免疫在信息交換�？梢钥闯觯琓ME 的三個(gè)特征彼此相關(guān)，形成復(fù)雜的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，腫瘤轉(zhuǎn)移。同時(shí)，TME 也阻礙了實(shí)體瘤免疫治療的發(fā)展和功效。 因此，探索境，開(kāi)發(fā)腫瘤靶向藥物對(duì)腫瘤微環(huán)境的獨(dú)特性質(zhì)具有重要的臨床價(jià)值。

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