【摘要】：目的:ANIT誘導的膽汁淤積性肝損傷病理表現與人體肝內膽汁淤積病變最為相似,也是研究膽汁淤積性肝病最常用的實驗動物模型,但是關于ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷的毒性分子機制報道確甚少。非諾貝特是過氧化物酶體增殖物活化受體alpha(Peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPARα)的激動劑,也是最常用的貝特類的抗高血脂藥物,近年來發(fā)現非諾貝特可對抗膽汁淤積性肝病,但是關于非諾貝特用于治療膽汁淤積性肝損傷并沒有并沒有明確的臨床用藥指導,說明仍有重要的毒理學與藥理學問題尚未解決。探究非諾貝特對抗膽汁淤積性肝病的作用與機制,對推動非諾貝特用于防治膽汁淤積性肝病有重要現實意義。方法:1、非諾貝特抗膽汁淤積性肝損傷的作用:野生型小鼠隨機分為8組:陰性對照組(WTC)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WT-A)、ANIT非諾貝特三個組(WT-A-F5、25、125)、非諾貝特劑量組(WT-F5、25、125)。非諾貝特和ANIT均溶于玉米溶劑中,灌胃給藥非諾貝特5、25、125mg/kg每天2次,連續(xù)5天,在第4天的時候單劑量灌胃給予毒性藥ANIT,48后經過量CO2麻醉處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。2、Ppara-null小鼠驗證PPARα的作用:非諾貝特按照上述實驗篩選發(fā)揮預保護作用的劑量,然后選用Ppara-null型小鼠驗證PPARα的作用。Ppara-null型健康雄性小鼠隨機分為4組:陰性對照組(KO-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(KO-A)、ANIT非諾貝特組(KO-A-F25)、非諾貝特劑量組(KO-F25)。非諾貝特和ANIT均溶于玉米溶劑中,灌胃給予非諾貝特25mg/kg每天2次,連續(xù)5天,在第4天的時候單劑量灌胃給予毒性藥ANIT,48后經過量CO2麻醉處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。3、PPARα標準激動劑WY-14643的驗證PPARα的作用:野生型小鼠隨機分為4組:陰性對照組(WT-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WT-A)、ANIT/WY-14643(WT-A-WY)、WY-14643組(WT-WY)。WT-A-WY和WY-14643組飼連續(xù)養(yǎng)0.1%的WY-14643飼料5天,在第4天WT-A和WT-A-WY組別單劑量給予ANIT 75mg/kg,48小時后量CO2麻醉處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。4、JNK炎癥通路抑制劑SP600125的反向驗證JNK的作用:野生型小鼠隨機分為4組:陰性對照組(WT-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WTA)、ANIT SP600125(WT-A-SP)、SP600125組(WT-SP)。WT-A-SP和SP600125組腹腔注射SP600125 15mg/kg,半小時后WT-A和WT-A-SP灌胃給予ANIT 75mg/kg,48小時后量CO2處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。5、非諾貝特高劑量組SP600125反向驗證JNK的作用:為驗證高劑量組的損傷來自于JNK炎癥通路的不完全抑制,將野生型小鼠隨機分為4組:陰性對照組(WT-C)、膽汁淤積性肝損傷模型組(WT-A)、ANIT/非諾貝特125mg/kg(WT-A-F125)、ANIT/非諾貝特/SP600125組(WT-A-F-SP)。灌胃給藥非諾貝特125mg/kg每天2次,連續(xù)5天,在第4天的時候,WT-A-F-SP組腹腔注射SP600125 15mg/kg,半小時后WT-A和WT-A-F-SP灌胃給予ANIT75mg/kg,48小時后量CO2處死小鼠后收集小鼠血液和肝臟。結果:1、生化和組織學檢查顯示非諾貝特25 mg/kg一天兩次可完全抑制ANIT誘導的膽汁淤積和肝臟損傷;2、這種保護作用僅發(fā)生在野生型小鼠中,在Ppara-null型小鼠中無上述保護作用。3、經過Q-PCR分析發(fā)現:膽酸合成和轉運相關的基因多發(fā)生適應性的改變而非非諾貝特的直接調節(jié);但是非諾貝特對Oapt1具有下調作用而對Mrp4具有上調作用,這對緩解ANIT引起的膽汁淤積具有緩解作用;蛋白免疫印跡分析發(fā)現:在所有發(fā)生膽汁淤積性肝損傷的組別中JNK炎癥通路處于激活狀態(tài);并且非諾貝特對NF-κB、STAT3、JNK信號通路均有抑制作用。4、WY-14643可完全抑制ANIT誘導的膽汁淤積和肝損傷,同時抑制NF-κB、STAT3和JNK信號通路。5、JNK抑制劑SP600125能通過抑制JNK炎癥通路強效抑制ANIT誘導的膽汁淤積性肝損傷。結論:JNK在ANIT誘導的膽汁淤積性肝損傷以及非諾貝特發(fā)揮抗ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷中擔任著非常重要的角色,總結為以下幾個方面:(1)JNK介導了ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷的炎癥反應。(2)非諾貝特可發(fā)揮防止ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷。(3)非諾貝特可以通過上調Mrp4下調Oatp1緩解膽汁酸的毒性負荷。(4)非諾貝特發(fā)揮防止ANIT引起的膽汁淤積性肝損傷主要是通過激活PPARα后抑制JNK炎癥反應而完成效果,并且具有劑量依賴性。
【學位授予單位】：寧波大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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