【摘要】：布羅佐噴鈉[Sodium(±)-5-Bromo-2-(α-hydroxypentyl)benzoate,5-溴-2-(α-羥基戊基)]苯甲酸鈉,商品名:Brozopine,BZP)是由鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院在恩必普(1-3-n-Butylphthalide,NBP)的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾、構(gòu)效關(guān)系評(píng)價(jià)、藥理毒理研究、作用機(jī)制探討等合成出來(lái)的,具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型化合物,目前已經(jīng)進(jìn)入了Ⅱ期臨床階段并取得良好的治療效果。我們的前期研究已經(jīng)充分證明了BZP對(duì)缺血性腦卒中有保護(hù)作用,但其藥物作用靶點(diǎn)尚未闡明。因此本次課題我們擬從分子層面闡述BZP抗腦缺血的調(diào)控靶點(diǎn)及作用機(jī)制。通過(guò)清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的化學(xué)對(duì)接模擬,發(fā)現(xiàn)BZP與15-LOX-2的結(jié)合自由能相比于15-LOX-1更高,有更強(qiáng)的親和性,故可能的靶蛋白中15-LOX-1被排除。離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)BZP與15-LOX-2的抑制劑C8E4作用相似,推斷BZP為15-LOX-2的抑制劑,而15-LOX-2可能為布羅佐噴鈉抗腦缺血的調(diào)控靶點(diǎn),為缺血腦損傷的修復(fù)提供了一種藥物作用的新靶點(diǎn)和新的修復(fù)機(jī)制。第Ⅰ部分BZP對(duì)大鼠腦缺血后15-LOX-2代謝通路的影響目的:建立大鼠MCAO模型,觀察BZP腸溶微丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用并探討其對(duì)大鼠腦缺血后15-LOX-2代謝通路的影響。方法:MCAO模型的建立采用改良的Zea-longa線栓法建立MCAO模型。BZP腸溶微丸給藥劑量的確定繪制BZP腸溶微丸的量效曲線,確定BZP腸溶微丸的給藥劑量。分組與給藥將SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組:Sham組;Model組;BZP腸溶微丸組;C8E4組。觀察指標(biāo)觀察BZP腸溶微丸對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,包括病理改變(HE染色),神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,腦梗死體積,腦水腫的變化;免疫組化檢測(cè)15-LOX-2,用ELⅠSA試劑盒檢測(cè)15-LOX-2代謝產(chǎn)物15-HETE、大鼠核因子κB亞基p65(NF-κB p65)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(ⅠL-6)、細(xì)胞間粘附分子1(ⅠCAM-1)的含量。結(jié)果:1.BZP腸溶微丸量效曲線的繪制根據(jù)BZP腸溶微丸對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的量效曲線,BZP腸溶微丸給藥劑量(0.6,1.2,2.5,5.0,10,20 mg/kg)為橫坐標(biāo),神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積、腦水腫為縱坐標(biāo)繪制BZP腸溶微丸量效曲線。梗死體積是評(píng)價(jià)腦梗死的金指標(biāo),確定BZP腸溶微丸的最小有效量為1.2mg/kg,而20 mg/kg BZP腸溶微丸給藥組與10mg/kg的BZP腸溶微丸給藥組相比無(wú)顯著差異,故10 mg/kg為BZP腸溶微丸的最大有效劑量,實(shí)驗(yàn)選擇終劑量10 mg/kg的BZP腸溶微丸進(jìn)行機(jī)制研究。2.組織形態(tài)學(xué)影響HE染色結(jié)果顯示:Sham組組織結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞密集,排列整齊,細(xì)胞核居中,核仁清晰,細(xì)胞間隙致密無(wú)水腫。與Sham組相比,Model組梗塞側(cè)的腦組織細(xì)胞體積縮小,胞質(zhì)透亮,著色變淺,不均勻,細(xì)胞核固縮,核質(zhì)比減小,出現(xiàn)許多空泡,細(xì)胞排列疏松紊亂,間隙變大,皮層、海馬、紋狀體壞死神經(jīng)元占總神經(jīng)元的比例分別為(60.98±9.29)%,(57.22±9.10)%,(41.11±6.43)%;與Model組相比,BZP腸溶微丸(1.2,2.5,5.0,10.0,20.0 mg/kg)組病理改變有不同程度的減輕,空泡明顯減少,并呈現(xiàn)劑量依賴性;在皮層區(qū),用藥組各壞死神經(jīng)元占總神經(jīng)元的比例分別為(50.76±3.57)%,(39.31±4.96)%,(29.14±2.96)%,(19.31±4.51)%,(20.97±2.25)%;(P0.01,P0.05);在海馬區(qū),用藥組各壞死神經(jīng)元占總神經(jīng)元的比例分別為(47.49±9.08)%,(36.29±7.85)%,(24.04±6.42)%,(15.03±2.40)%,(14.20±5.06)%;(P0.01,P0.05);在紋狀體,用藥組各壞死神經(jīng)元占總神經(jīng)元的比例分別為(34.57±7.09)%,(27.13±7.21)%,(19.02±5.73)%,(12.32±1.77)%,(12.66±3.87)%;(P0.01,P0.05)。而且等摩爾劑量的BZP腸溶微丸與C8E4組相比,BZP腸溶微丸組改善效果更明顯。3.神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積、腦水腫體積的變化與Sham組相比,Model組動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分(神經(jīng)行為缺失)較高,出現(xiàn)手術(shù)對(duì)側(cè)肩內(nèi)旋,前肢內(nèi)收;推動(dòng)雙肩時(shí),手術(shù)對(duì)側(cè)抵抗力下降,行走繞圈,少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)無(wú)自發(fā)活動(dòng),意識(shí)障礙,有較大的腦梗塞體積和嚴(yán)重的腦水腫(P0.01);與Model組相比,BZP腸溶微丸(1.2,2.5,5.0,10,20 mg/kg)組均可改善神經(jīng)缺失癥狀,減小腦梗塞體積,減輕腦水腫,并呈現(xiàn)劑量依賴性(P0.05;P0.01),其中BZP(0.6mg/kg)組和等摩爾劑量C8E4(10mg/kg)組與Model組相比均無(wú)明顯差異(P0.05)。BZP微丸(10mg/kg)組與C8E4(10mg/kg)組相比有顯著差異(P0.01)。4.15-LOX-2的表達(dá)量免疫組化結(jié)果顯示:與Sham組相比,Model組皮層,海馬,紋狀體三個(gè)區(qū)域15-LOX-2的表達(dá)量均顯著升高(P0.01);與Model組相比,BZP(10mg/kg)腸溶微丸組與等摩爾劑量C8E4(10mg/kg)組15-LOX-2的表達(dá)量均顯著減少(P0.01),其中10mg/kg的BZP腸溶微丸與等摩爾劑量C8E4組相比無(wú)顯著差異(P0.05),說(shuō)明BZP為15-LOX-2的抑制劑。5.15-HETE含量變化與Sham組(45.15±0.73 pg/ml)相比,Model組15-HETE的含量顯著升高(93.94±0.49 pg/ml;P0.01);與Model組相比,BZP(10 mg/kg)腸溶微丸組可減少15-HETE的生成(56.67±1.2 pg/ml;P0.05),而等摩爾劑量C8E4(10mg/kg)組可明顯降低15-HETE的含量(52.65±0.95 pg/ml;P0.01),其中10mg/kg的BZP腸溶微丸與等摩爾劑量C8E4組相比無(wú)顯著差異(P0.05)。6.NF-κB p65含量的變化與Sham組(9.93±0.48 ng/mg)相比,Model組NF-κB的含量顯著升高(61.03±0.82 ng/mg;P0.01);與Model組相比,BZP(10mg/kg)腸溶微丸組和等摩爾劑量的C8E4(10mg/kg)組均可顯著降低NF-κB的含量(11.63±0.96ng/mg,22.89±0.35ng/mg;P0.01),其中10mg/kg的BZP腸溶微丸效果優(yōu)于等摩爾劑量C8E4組(P0.05)。7.TNF-α含量變化與Sham組(10.52±0.14 ng/mg)相比,Model組TNF-α的含量顯著升高(29.08±0.15 ng/mg;P0.01);與Model組相比,BZP(10mg/kg)腸溶微丸組可降低TNF-α的含量(12.2±0.71 ng/mg;P0.05),而等摩爾劑量C8E4(10mg/kg)組TNF-α的含量為21.87±1.17 ng/mg,其中10mg/kg的BZP腸溶微丸效果優(yōu)于等摩爾劑量C8E4組(P0.05)。8.ⅠL-6含量變化與Sham組(15.33±0.17 ng/mg)相比,Model組ⅠL-6的含量升高(34.37±0.76 pg/mg;P0.05);與Model組相比,BZP(10mg/kg)腸溶微丸組可明顯降低ⅠL-6的含量(17.87±0.97 ng/mg;P0.01),而等摩爾劑量C8E4(10mg/kg)組ⅠL-6的含量為27.95±1.1ng/mg,其中10mg/kg的BZP腸溶微丸效果優(yōu)于等摩爾劑量C8E4組(P0.05)。9.ⅠCAM-1含量變化與Sham組(73.63±0.46 ng/mg)相比,Model組ⅠCAM-1的含量顯著升高(147.1±1.29 ng/mg;P0.01);與Model組相比,BZP(10mg/kg)腸溶微丸組和等摩爾劑量C8E4(10mg/kg)組均可降低ⅠCAM-1的含量(97.36±0.52 ng/mg,116.6±0.22 ng/mg;P0.01,P0.05),其中10mg/kg的BZP腸溶微丸效果優(yōu)于等摩爾劑量C8E4組(P0.05)。結(jié)論:BZP腸溶微丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有預(yù)防作用,其機(jī)制通過(guò)抑制15-LOX-2的活性,進(jìn)而抑制NF-κB,ⅠL-6,TNF-α和ⅠCAM-1炎癥因子的表達(dá),說(shuō)明BZP為15-LOX-2的抑制劑,15-LOX-2可能為布羅佐噴鈉抗腦缺血的調(diào)控靶點(diǎn)。第Ⅱ部分BZP對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞缺氧損傷后15-LOX-2代謝通路的影響目的:探究布羅佐噴鈉(Brozopine,BZP)對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的預(yù)防作用機(jī)制,從而為臨床應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。方法:OGD/R損傷模型的建立:采用含30mmol Na2S2O4的低糖培養(yǎng)基造成PC12細(xì)胞缺氧缺糖2h,然后換正常培養(yǎng)基復(fù)氧復(fù)糖24h,建立穩(wěn)定的PC12細(xì)胞OGD/R損傷模型。分組與給藥隨機(jī)分為4組:Sham組;Model組;BZP組;C8E4組。BZP、C8E4組均需加入對(duì)應(yīng)濃度的BZP、C8E4預(yù)處理24小時(shí)后,再進(jìn)行OGD/R損傷處理。觀察指標(biāo):觀察BZP對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;用ELⅠSA試劑盒檢測(cè)15-LOX-2代謝產(chǎn)物15-HETE、大鼠核因子κB亞基p65(NF-κB p65)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(ⅠL-6)、細(xì)胞間粘附分子1(ⅠCAM-1)的含量。結(jié)果:1.BZP量效關(guān)系曲線的確定與Control組相比,OGD/R損傷組的PC12細(xì)胞存活率明顯降低(50.6%;P0.01);與OGD/R損傷組相比,經(jīng)5、10、15、20、30、40μmol/L的BZP預(yù)處理的PC12細(xì)胞存活率均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(55.5%,61.7%,69.6%,77.8%,85.0%,81.3%;P0.05,P0.01);根據(jù)BZP對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的量效曲線,經(jīng)40μmol/L BZP預(yù)處理的PC12細(xì)胞存活率與30μmol/L的BZP相比略有下降趨勢(shì),故30μmol/L為BZP的最高有效濃度。綜上所述,實(shí)驗(yàn)選擇終濃度30μmol/L的BZP作用于OGD/R處理的PC12細(xì)胞進(jìn)行機(jī)制研究。陽(yáng)性對(duì)照藥C8E4按照與BZP等摩爾濃度計(jì)算得最終劑量30μmol/L,而C8E4(30μmol/L)組預(yù)處理的PC12細(xì)胞存活率為62.8%,BZP(30μmol/L)組與C8E4(30μmol/L)組相比有顯著差異(P0.01)。2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Control組神經(jīng)細(xì)胞胞體較大,有較長(zhǎng)的樹(shù)突狀突起,呈多角形或梭形;OGD/R損傷組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,胞體縮小,部分細(xì)胞無(wú)突起,部分神經(jīng)細(xì)胞呈圓形;與OGD/R損傷組相比,經(jīng)5、10、15、20、30、40μmol/L BZP、30μmol/L C8E4組處理后,可改善神經(jīng)細(xì)胞的損傷,胞體較大,有樹(shù)突狀突起。而等摩爾濃度的BZP與C8E4組相比,改善效果更明顯。3.15-HETE含量變化與Control組(39.13±1.2 pg/ml)相比,OGD/R損傷組15-HETE的含量顯著升高(73.79±0.82 pg/ml;P0.01);與OGD/R損傷組相比,BZP(30μmol/L)組可明顯減少15-HETE的生成(47.71±0.87 pg/ml;P0.01),而C8E4(30μmol/L)組也可降低15-HETE的含量(45.79±0.16 pg/ml;P0.05),其中30μmol/L的BZP與等摩爾劑量的C8E4組相比無(wú)顯著差異(P0.05)。4.NF-κB p65含量的變化與Control組(84.79±0.91 pg/ml)相比,OGD/R損傷組NF-κB的含量顯著升高(178.36±1.72 pg/ml;P0.01);與OGD/R損傷組相比,BZP(30μmol/L)組可顯著降低NF-κB的含量(104.79±8.59 pg/ml;P0.01),而C8E4(30μmol/L)組也可降低NF-κB的含量(113.43±3.43 pg/ml;P0.05),其中30μmol/L的BZP與等摩爾濃度的C8E4組相比無(wú)差異(P0.05)。5.TNF-α含量變化與Control組(31.77±2.76 pg/ml)相比,OGD/R損傷組TNF-α的含量升高(94.82±1.03 pg/ml;P0.05);與OGD/R損傷組相比,BZP(30μmol/L)組可顯著降低TNF-α的含量(33.68±1.99 pg/ml;P0.01),而C8E4(30μmol/L)組也可降低TNF-α的含量(76.18±1.67 pg/ml;P0.05),其中30μmol/L的BZP效果優(yōu)于等摩爾濃度的C8E4組(P0.01)。6.ⅠL-6含量變化與Control組(33.08±1.06 pg/ml)相比,OGD/R損傷組ⅠL-6的含量升高(112.92±3.89 pg/ml;P0.05);與OGD/R損傷組相比,BZP(30μmol/L)組可降低ⅠL-6的含量(60.92±1.30 pg/ml;P0.05),而C8E4(30μmol/L)組ⅠL-6的含量為98.83±2.60 pg/ml,其中30μmol/L的BZP與等摩爾濃度的C8E4組相比有差異(P0.05)。7.ⅠCAM-1含量變化與Control組(45.07±9.39 pg/ml)相比,OGD/R損傷組ⅠCAM-1的含量顯著升高(372.5±5.15 pg/ml;P0.01);與OGD/R損傷組相比,BZP(30μmol/L)組和C8E4(30μmol/L)組均可顯著降低ⅠCAM-1的含量(83.64±4.55 pg/ml,213.29±2.42 pg/ml;P0.01),其中30μmol/L的BZP效果優(yōu)于等摩爾濃度的C8E4組(P0.01)。結(jié)論:BZP對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有預(yù)防作用,其機(jī)制通過(guò)抑制15-LOX-2代謝產(chǎn)物15-HETE的生成,進(jìn)而抑制NF-κB,ⅠL-6,TNF-α和ⅠCAM-1炎癥因子的表達(dá),說(shuō)明BZP為15-LOX-2的抑制劑,15-LOX-2可能為布羅佐噴鈉抗腦缺血的調(diào)控靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2716174