【摘要】：腫瘤是威脅人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾病。傳統(tǒng)的化療由于缺乏特異性,對(duì)正常組織產(chǎn)生較大的毒副作用。納米藥物遞送系統(tǒng)(Nano-drug delivery systems,NDDS)可通過(guò)高通透性和滯留(Enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng)提高在腫瘤組織的分布,但依然存在遞送效率低,釋藥不完全,無(wú)法實(shí)現(xiàn)深部腫瘤滲透等難題。因此,為了提高NDDS對(duì)腫瘤的靶向性,實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的響應(yīng)性釋放,并進(jìn)一步將藥物遞送至深部腫瘤組織,本課題以具有良好生物相容性的天然多糖海藻酸鈉(Sodium Alginate,Alg)為基體材料,六水合三氯化鐵(FeCl_3·6H_2O)為交聯(lián)劑,阿霉素(Doxorubicin,DOX)為模型藥物,半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-賴(lài)氨酸(Cysteine-Arginine-Glycine-Aspartic acid-Lysine,CRGDK)五肽為靶分子,設(shè)計(jì)了一種腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)觸發(fā)粒徑轉(zhuǎn)變型納米制劑CRGDK-FeAlg/DOX。本課題通過(guò)簡(jiǎn)單的一步交聯(lián)法合成了海藻酸鐵(Iron-Alginate,FeAlg)納米凝膠作為藥物載體,并探究了不同合成條件對(duì)納米凝膠粒徑、形態(tài)的影響,確定了最佳合成工藝。為了使FeAlg納米載體具有主動(dòng)靶向性,我們通過(guò)碳二亞胺法將腫瘤靶向肽CRGDK接枝到Alg骨架上,再與FeCl_3?6H_2O交聯(lián)形成CRGDK-FeAlg,將其用于荷載抗腫瘤藥物DOX,得到最終納米制劑CRGDK-FeAlg/DOX。CRGDK-FeAlg/DOX在TME弱酸性和還原性條件下,Fe~(3+)被還原為Fe~(2+),納米凝膠自外向內(nèi)解交聯(lián),粒徑由大變小,一方面可以實(shí)現(xiàn)TME響應(yīng)性藥物釋放,另一方面可以增強(qiáng)納米制劑的深部腫瘤滲透作用。而且,釋放的Fe~(2+)可以與腫瘤組織高濃度的H_2O_2反應(yīng)產(chǎn)生·OH自由基,實(shí)現(xiàn)無(wú)O_2參與的腫瘤化學(xué)動(dòng)力學(xué)-化療聯(lián)合治療。體外研究結(jié)果表明CRGDK成功接枝到Alg骨架上,接枝率為14.68%。體外模擬TME條件下,FeAlg的粒徑從50 nm降低至10 nm甚至更小,表明FeAlg可以在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)粒徑轉(zhuǎn)變,這有利于納米制劑向深部腫瘤滲透。CRGDK-FeAlg可以高效負(fù)載DOX,載藥率和包封率分別為37.56%和40.12%。體外藥物釋放數(shù)據(jù)顯示,CRGDK-FeAlg/DOX在pH為5.5,2mM谷胱甘肽(Glutathione,GSH)中72 h的累積釋藥百分率高達(dá)81.98%,相比單純PBS組提高了49.69%,這為納米制劑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后精準(zhǔn)釋放藥物,增強(qiáng)藥物抗腫瘤效果,減少不良反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。細(xì)胞攝取結(jié)果表明,藥物作用1 h時(shí),細(xì)胞表面高度表達(dá)神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1,Nrp-1)受體的A549細(xì)胞對(duì)CRGDK-FeAlg/DOX的攝取量是FeAlg/DOX的2.87倍,這是由于CRGDK對(duì)Nrp-1受體具有高親和力,從而介導(dǎo)更多的納米制劑進(jìn)入細(xì)胞,而細(xì)胞表面低表達(dá)Nrp-1受體的MCF-7細(xì)胞對(duì)不同制劑的攝取無(wú)明顯差別。溶酶體共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制劑入胞后可以有效實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸,隨后DOX進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮抗腫瘤作用。體外活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)結(jié)果表明CRGDK-FeAlg可有效誘導(dǎo)ROS的生成。細(xì)胞凋亡結(jié)果表明,CRGDK-FeAlg/DOX(濃度5μg/mL)作用6 h的細(xì)胞凋亡率高達(dá)81.9%,是DOX組的1.7倍,表明CRGDK-FeAlg/DOX能高效誘導(dǎo)A549腫瘤細(xì)胞凋亡。Calcein-AM/PI活死細(xì)胞雙染結(jié)果表明,CRGDK-FeAlg/DOX在0.6μg/mL的濃度下作用24 h時(shí),細(xì)胞死亡百分率為65.93%,比DOX組提高了53.73%,這是因?yàn)镃RGDK-FeAlg/DOX不僅具有主動(dòng)靶向性,而且具有緩釋效應(yīng),能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持較大濃度,DOX協(xié)同?OH發(fā)揮最佳的抗腫瘤效果。細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CRGDK-FeAlg/DOX(5μg/mL)作用48h對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為75.26%,比游離DOX組提高了約36%。體外三維細(xì)胞球(Three-dimensional multicellular sphere,3DMCS)滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CRGDK-FeAlg/DOX可以有效實(shí)現(xiàn)深部腫瘤滲透,相較于粒徑不變的SiO_2納米粒,其滲透距離可增加大約60μm,這源于FeAlg的TME觸發(fā)式粒徑轉(zhuǎn)變效應(yīng),從而將DOX遞送至腫瘤深處,實(shí)現(xiàn)DOX在腫瘤組織的均勻分布,有利于其抗腫瘤效果的發(fā)揮。體內(nèi)以A549荷瘤裸鼠為動(dòng)物模型,小動(dòng)物活體成像結(jié)果表明CRGDK-FeAlg/DOX可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的高效蓄積和長(zhǎng)效滯留。腫瘤深部滲透結(jié)果表明CRGDK-FeAlg可以高效遞送抗腫瘤藥物DOX至腫瘤組織深部區(qū)域。腫瘤部位ROS產(chǎn)生結(jié)果表明,CRGDK-FeAlg能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生ROS,效果優(yōu)于FeAlg,可以與DOX協(xié)同發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CRGDK-FeAlg/DOX可顯著抑制體內(nèi)腫瘤增殖,治療結(jié)束的相對(duì)腫瘤體積(V/V_0)僅為1.13,明顯低于空白對(duì)照組(V/V_0為4.79)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R943
【圖文】：

第一章 前言海藻酸鹽的交聯(lián)是由 G 殘基的羧酸鹽基團(tuán)與金屬陽(yáng)離子螯合引起的，即兩個(gè) G殘基與一個(gè)金屬離子以“蛋-盒”2:1 螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合[36]，聚合物鏈之間的相互連接導(dǎo)致三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，從而用于小分子藥物、疫苗、多肽、siRNA 或者 DNA等的包封和可控遞送[19]�；诖�，我們擬構(gòu)建一種基于天然多糖 Alg 的納米凝膠，用于抗腫瘤藥物的遞送。

應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織后，Doxil 大量滯留于腫瘤組織外圍，造成藥物在度分布不均一，治療效率低[66]。降低的跨毛細(xì)血管壓力差，升高壓，以及細(xì)胞外基質(zhì)的致密結(jié)構(gòu)阻礙了納米顆粒的擴(kuò)散，極大地劑向腫瘤深部的滲透與均勻分布[67, 68]。將藥物遞送至整個(gè)腫瘤區(qū)效和良好預(yù)后的關(guān)鍵。克服腫瘤基質(zhì)屏障，增加藥物對(duì)實(shí)體瘤的強(qiáng)化療效果的主要挑戰(zhàn)之一[69, 70]。目前主要有兩種策略可供探索合理調(diào)控納米顆粒的理化性質(zhì)，包括顆粒大小、形狀和表面修飾腫瘤實(shí)質(zhì)的能力，另一種策略是重塑 TME，包括腫瘤血管和基質(zhì)環(huán)影響納米顆粒深度穿透效率的一個(gè)重要參數(shù)[72-74]。大顆粒(100 n血管的高外滲及腫瘤組織蓄積，但由于在腫瘤基質(zhì)中擴(kuò)散障礙大深部腫瘤。相反，顆粒越小，擴(kuò)散障礙越小，越有利于腫瘤的深部速度快，循環(huán)時(shí)間短，腫瘤蓄積有限[75]。因此，我們希望設(shè)計(jì)一 NDDS，該系統(tǒng)在循環(huán)過(guò)程中能夠維持其初始大小，以允許較長(zhǎng)的好的 EPR 滲漏效應(yīng)，然后在腫瘤部位發(fā)生響應(yīng)性粒徑轉(zhuǎn)換，從而的優(yōu)點(diǎn)，增加腫瘤蓄積，促進(jìn)深度穿透。

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本文編號(hào)：2715869