【摘要】：氨基糖苷類抗生素引起的藥物性耳聾已成為影響全世界人類健康的重要問題,臨床上對(duì)其尚無行之有效的治療策略,尋找一些藥物來治療藥物性耳聾是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。藥物性耳聾的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)耳毛細(xì)胞凋亡,傳統(tǒng)治療方法作用效果低,無法滿足臨床要求。為達(dá)到有效的藥物治療效果,本課題擬設(shè)計(jì)一種脂質(zhì)體載藥系統(tǒng),裝載水溶性藥物鹽酸米諾環(huán)素,利用多肽SS31(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)對(duì)脂質(zhì)體(Lp)進(jìn)行表面修飾,期望減小氨基糖苷類抗生素-慶大霉素造成的耳蝸毛細(xì)胞損傷從而達(dá)到治療藥物性耳聾的目的。處方前研究中,本文通過考察鹽酸米諾環(huán)素在不同分散介質(zhì)中紫外吸收光譜,選擇等吸收點(diǎn)作為藥物含量測(cè)定的最佳檢測(cè)波長(zhǎng),進(jìn)而建立鹽酸米諾環(huán)素的體外分析方法。確定鹽酸米諾環(huán)素在pH為4.36-6.00內(nèi)的等吸收點(diǎn)為380 nm,pH為6.80-8.73內(nèi)的等吸收點(diǎn)為358 nm;不同鈣離子的HEPES-蔗糖(HBS)緩沖溶液中的等吸收點(diǎn)為357 nm;不同鎂離子的HBS緩沖液中的等吸收點(diǎn)為350nm。鹽酸米諾環(huán)素在不同pH條件下及甲醇溶液中的線性、精密度及回收率均符合要求�？疾炝他}酸米諾環(huán)素(MC)溶液的穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,在pH 5.50-7.40的范圍內(nèi),鹽酸米諾環(huán)素的穩(wěn)定性受pH、光照的影響不大,但隨著溫度的升高鹽酸米諾環(huán)素降解速度加快。采用鈣離子梯度主動(dòng)載藥法制備鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體,建立了Sephadex G-50微柱測(cè)定鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體包封率的方法。以包封率和載藥量為參考指標(biāo),考察鈣離子濃度、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、膽固醇含量、磷脂濃度、藥脂比等處方因素及載藥溫度、載藥時(shí)間等工藝因素的影響,最終確定鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為氫化大豆磷脂/膽固醇/磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(HSPC/Chol/DSPE-PEG2000)=70:24.4:5.6(molar ratio),水化介質(zhì)鈣離子濃度為120 mM,磷脂濃度為8.7 mg/ml,藥脂比為1:10(Wt/Wt);載藥溫度為60℃,載藥時(shí)間為15 min。該條件下Lp/MC包封率為97.8%,載藥量為8.9%。采用點(diǎn)擊化學(xué)方法(SS31-Cys和DSPE-PEG2000-MAL反應(yīng))進(jìn)行修飾脂質(zhì)體SS31-Lp/MC的制備,高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫法確定SS31的連接率為82.3%±4.5%,SS31-Lp/MC包封率為93.4%,載藥量為8.5%。最優(yōu)處方脂質(zhì)體Lp/MC及脂質(zhì)體SS31-Lp/MC的粒徑分別為143.5 nm及149.9 nm,Zeta電位分別為-35.0 mV和-25.8 mV;穩(wěn)定性結(jié)果顯示兩種脂質(zhì)體在4℃下避光放置8周,粒徑、藥物含量并未明顯改變,表明SS31化后對(duì)脂質(zhì)體的理化性質(zhì)無明顯的影響;以HBS緩沖液為介質(zhì),考察兩種脂質(zhì)體在不同pH及不同濃度牛血清蛋白(BSA)條件下的釋放狀態(tài),結(jié)果表明pH及BSA濃度并未影響鹽酸米諾環(huán)素的釋放狀態(tài),同一條件下,脂質(zhì)體SS31-Lp/MC明顯比Lp/MC釋放加快。建立斑馬魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,考察鹽酸米諾環(huán)素、空白脂質(zhì)體Lp和SS31-Lp及慶大霉素(GT)對(duì)斑馬魚側(cè)線毛細(xì)胞的毒性作用,同時(shí)考察了鹽酸米諾環(huán)素、空白修飾脂質(zhì)體SS31-Lp、脂質(zhì)體Lp/MC和SS31-Lp/MC預(yù)處理對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用;研究了脂質(zhì)體對(duì)毛細(xì)胞力傳導(dǎo)(MET)通道攝取及線粒體膜電位的影響。結(jié)果表明,鹽酸米諾環(huán)素及慶大霉素對(duì)毛細(xì)胞的損傷存在劑量依賴型;兩種空白脂質(zhì)體對(duì)毛細(xì)胞無損傷作用;在慢毒作用模式下,SS31-Lp/MC對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng),DASPEI及DiOC2(3)兩種評(píng)分結(jié)果均與慶大霉素毒性處理組存在顯著性差異;脂質(zhì)體并未影響毛細(xì)胞MET通道的功能,未減少慶大霉素的攝取。
【學(xué)位授予單位】：江西科技師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943
【圖文】：

第 2 章 鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體的處方前研究.6.4 不同 pH 條件下光照影響實(shí)驗(yàn)取適量不同 pH 條件的樣品溶液，分別置于棕色及透明細(xì)口瓶?jī)?nèi)，封口，置于干燥通風(fēng)處，在 0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h，48 h，72 h 取樣應(yīng)波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，考察光照對(duì)穩(wěn)定性的影響，每組平行三個(gè)樣。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 不同條件下檢測(cè)波長(zhǎng)的確定.1.1 以不同 pH 的 HBS 緩沖液為介質(zhì)鹽酸米諾環(huán)素在不同 pH 的 HBS 緩沖液中的 UV 吸收波譜。結(jié)果顯示 為 4.36～6.00 時(shí)，其吸收波譜在 380 nm 存在等吸收點(diǎn)（見圖 2-1）；在 p0～8.73 時(shí)，其吸收波譜在 358 nm 存在等吸收點(diǎn)（見圖 2-2）。

圖 2-2 鹽酸米諾環(huán)素在 pH 為 6.80～8.73 的 HBS 緩沖液中的紫外吸收波譜Fig 2-2 The UV absorption spectrum of MC in HBS buffer at pH 6.80～8.73..1.2 以含鈣離子的 HBS 緩沖液為介質(zhì)鹽酸米諾環(huán)素在含鈣離子濃度的 HBS 緩沖液中吸收波譜如圖 2-3 所示7 nm 存在等吸收點(diǎn)。

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