【摘要】：侵襲性真菌感染已成為人類健康的嚴重威脅,其主要治療手段為藥物治療。臨床常用抗真菌藥物包括氮唑類、多烯類、棘白菌素類等,但耐藥性增加、嚴重的毒副作用、半衰期短等缺陷正在逐漸限制現有藥物的臨床使用,而近年來多重耐藥真菌的出現,更使得抗真菌新藥研發(fā)與新靶點研究的需求變得更加迫切。細胞壁作為真菌區(qū)別于哺乳動物的特有細胞結構,在真菌的各項生命活動中都發(fā)揮著重要作用。真菌細胞壁由內層的以葡聚糖骨架為主的多聚糖層以及外層的糖蛋白層構成,細胞壁蛋白質大部分通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)殘基被錨定在細胞壁內層上,稱為細胞壁GPI錨定蛋白(GPI-CWP),這些蛋白在真菌的生命活動中發(fā)揮了重要作用,因此通過抑制GPI錨的合成破壞真菌細胞壁成為了抗真菌藥物與靶點研究的一大熱點。本課題組前期在現有的以GPI合成通路中肌醇酰基轉移酶Gwt1蛋白為靶點的10b、E1210、G884等GPI合成抑制劑的結構基礎上,設計合成了具有較好抗真菌活性的氨基吡啶類化合物NT-89(曾用名GPI-89),并驗證了其對于白念珠菌細胞壁結構的破壞作用。本課題將在前期研究的基礎上進一步研究NT-89的體內外抗真菌活性與作用機制,為新藥研發(fā)提供參考。我們首先通過測定最低抑菌濃度(MIC),考察了41株白念珠菌以及多種其他真菌對NT-89的藥物敏感性,并與氮唑類藥物進行比較,同時考察了NT-89與氮唑類藥物的相互作用關系。結果顯示NT-89能夠有效抑制白念珠菌生長且不受氟康唑耐藥性影響,MIC_(80)范圍為0.0625-0.5μg/mL,對其他真菌也表現出良好抑菌活性,但對皮膚癬菌無抑制作用。NT-89與氟康唑等氮唑類藥物合用在體外主要表現為協(xié)同或相加作用。在對NT-89對白念珠菌毒力因子抑制作用的考察中,我們發(fā)現低濃度的NT-89即能夠顯著抑制白念珠菌的黏附、菌絲以及生物被膜的形成。利用白念珠菌系統(tǒng)性感染小鼠模型,我們考察了NT-89單獨使用以及與氟康唑合用的體內活性,結果顯示一定治療濃度下的NT-89能夠延長白念珠菌感染小鼠的生存時間,與低濃度氟康唑合用在體內表現出協(xié)同作用,不同給藥途徑的療效存在差異。接下來我們通過構建白念珠菌GWT1單基因缺失(GWT1/gwt1Δ)菌株驗證NT-89的作用靶點,結果顯示GWT1/gwt1Δ菌株對NT-89的敏感性高于親本菌SN152,菌絲生長更易受到NT-89的抑制,提示GWT1表達產物可能是NT-89的作用靶點。通過利用GC-MS對白念珠菌甾醇組成的分析以及RT-qPCR對甾醇合成通路中關鍵酶的基因表達水平的檢測,我們發(fā)現NT-89還影響了白念珠菌麥角甾醇的合成通路,通路中的關鍵酶被直接或間接抑制,使得甾醇合成的中間產物增加,麥角甾醇合成減少,這一機制有助于NT-89發(fā)揮抗真菌作用,并有可能是NT-89與氮唑類藥物產生協(xié)同作用的原因。最后我們利用定量蛋白質組學技術iTRAQ檢測并分析了NT-89處理后白念珠菌蛋白質組的含量變化。結果顯示,在NT-89處理后可見GPI錨定蛋白含量減少,其中Ywp1p、Pga10p等與真菌侵襲和毒力相關的蛋白含量減少最顯著,此外部分與細胞壁修復有關的GPI錨定蛋白含量增加,提示在細胞壁表面糖蛋白缺失引起細胞壁結構被破壞后,白念珠菌細胞通過反饋調節(jié)增強了對細胞壁的修復,而蛋白質合成有關蛋白表達的增加也表明細胞增強了蛋白質的合成以加強對細胞壁的修復。綜上所述,NT-89是一種具有良好體內外抗真菌活性的新型抗真菌化合物,并能夠抑制真菌的黏附與菌絲等毒力因子,它能通過抑制GPI錨合成通路中的Gwt1蛋白,減少細胞壁GPI錨定蛋白的含量并抑制真菌生長,此外NT-89還能夠影響白念珠菌的麥角甾醇合成通路。有關NT-89抗真菌作用的具體機制還有待于更進一步的研究。 【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

【圖文】：

海軍軍醫(yī)大學碩士學位論文- 74 -發(fā)了對真菌具有更高選擇性的VT-1161與VT-1129等四氮唑類藥物（見圖1 a、b）[14]。1.1 VT-1161VT-1161 對真菌的 CYP51 具有比其他氮唑類藥物更高的選擇性，對白念珠菌CYP51 的親和力（Kd≤39 nM）超過了對人體中同源酶體的 2 000 倍以上[15]。它能夠有效抑制 CYP51 活性（半抑制濃度 IC50范圍 1.4~1.6 μM），使白念珠菌中麥角甾醇含量降低95%[15]。VT-1161體外抑制白念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.002 μg/mL，對耐氟康唑菌株的 MIC90為 0.12 μg/mL[15-16]；還可有效作用于小鼠的球孢子菌病（球孢子菌體外 MIC90為 2 μg/mL）、皮膚癬菌引起的淺部真菌感染以及根霉菌感染引起的毛霉菌病等感染模型[17-20]。小鼠體內藥動學實驗顯示，，VT-1161 具有分布體積廣（1.4L/kg）、口服生物利用度高（73%）、半衰期長（＞48 h）等特點[16]。VT-1161 目前已經完成了治療（趾）甲真菌病和復發(fā)性陰道念珠菌病的 IIb 期臨床試驗[16]。1.2 VT-1129VT-1129 具有與 VT-1161 相同的基本骨架，主要表現出對隱球菌，如新生隱球菌（MIC90為 0.060 μg/mL）和格特隱球菌（MIC90為 0.25 μg/mL）等的抑制活性[21]，對耐氟康唑的新生隱球菌具有一定的抑制作用（MIC50為 0.25 μg/mL ，MIC90為 2 μg/mL）[22]。VT-1129對隱球菌的CYP51具有強親和力及選擇性抑制作用（Kd值為14~25 nM

2.2 SCY-078SCY-078（原名MK-3118，Scynexis Inc.，見圖2 b）是天然化合物Enfumafungin[38-39]（提取自植物內生真菌 Hormonema sp.）的半合成衍生物，具有不同于棘白菌素的三萜烯結構[38]，是一種新型的口服 β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑[40]。SCY-078 在體內外均能發(fā)揮對念珠菌的抑制作用[41,42]，對念珠菌或曲霉菌的抑制活性略低于棘白菌素

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本文編號：2711988