【摘要】：目的:探討姜黃素介導的光動力療法(photodynamic therapy,PDT)體外對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)及其生物膜活性的影響。方法:1.姜黃素溶于0.5%二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide,DMSO)配置成不同濃度(1,6.25,12.5,25μM)的溶液,單純DMSO作為對照。利用單態(tài)氧熒光探針(Singlet Oxygen Sensor Green reagent,SOSG)驗證PDT作用下姜黃素產(chǎn)生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的情況。2.實驗對象為MRSA懸液和MRSA生物膜,均分為四組。MRSA懸液組和MRSA生物膜組的姜黃素濃度梯度皆為1、6.25、12.5、25μM。分組處理:(1)單純姜黃素組:分別加入各濃度姜黃素后,37℃孵育30 min,不給予照射。(2)單純PDT組:僅給予450 nm波長光源照射(輻照度1 W/cm2,照射時間5 min)。(3)姜黃素-PDT組:分別加入各濃度姜黃素后,37℃孵育30 min,然后450 nm波長光源照射(輻照度1 W/cm2,照射時間5 min)。(4)空白對照組:不給予姜黃素,不給予照射。處理后稀釋平板法檢測MRSA浮游菌存活率,MTT法測定生物膜內(nèi)MRSA存活率。MRSA生物膜通過結(jié)晶紫染色后光學顯微鏡下進行鑒定與觀察結(jié)構(gòu)改變。3.實驗對象為小鼠成骨細胞,分組及處理同細菌實驗,但姜黃素只用最高濃度25μM。分組處理后,應(yīng)用細胞形態(tài)觀察及MTT法兩種方式檢測姜黃素介導PDT的細胞毒性。結(jié)果:1.SOSG檢測結(jié)果顯示,姜黃素在PDT作用下產(chǎn)生ROS呈濃度依賴性;當姜黃素濃度一定時,產(chǎn)生ROS量隨時間增長,5 min后趨于穩(wěn)定。2.實驗濃度范圍內(nèi),姜黃素-PDT組對MRSA浮游菌及生物膜內(nèi)MRSA的均有顯著殺傷作用,且呈姜黃素濃度依賴性。姜黃素濃度為1μM時,MRSA浮游菌存活率為(95.62±1.24)%(P0.05),生物膜內(nèi)MRSA的存活率為(96.60±0.89)%(P0.05),差異有統(tǒng)計學意義但殺傷抑制作用微弱;濃度為25μM時,MRSA浮游菌存活率降至(0.38±0.32)%(P0.05),達到99%以上的殺傷,生物膜內(nèi)MRSA的存活率為(34.50±1.44)%(P0.05)。同時,結(jié)晶紫染色后光鏡下觀察結(jié)果顯示,25μM姜黃素介導PDT可使生物膜結(jié)構(gòu)散亂、完整性破壞明顯。單純姜黃素組、單純PDT組與空白對照組相比結(jié)果無統(tǒng)計學意義。3.細胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示:分組處理后,各組成骨細胞生長良好,呈長梭形或不規(guī)則形狀,與空白對照組相比,細胞形態(tài)、密度無顯著差別;MTT實驗顯示:4組結(jié)果均屬RGR分級“0”或“1”級,未檢測到姜黃素介導PDT的細胞毒性。結(jié)論:姜黃素介導PDT在體外對MRSA浮游菌及生物膜內(nèi)MRSA皆有良好的殺傷作用,但MRSA浮游菌較生物膜內(nèi)細菌對姜黃素光動力處理更加敏感。姜黃素介導PDT可有效破壞MRSA生物膜結(jié)構(gòu)。細胞毒性實驗未檢測到姜黃素對成骨細胞的細胞毒性。姜黃素介導PDT為MRSA型PJI的治療提供一個新的藥物選擇與視角。 【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

【圖文】：

SG 結(jié)果顯示，不同濃度姜黃素（6.25、12.5、25 μM）在 PDT 作用 1 mi度值與 DMSO 相比均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而且姜黃素濃度越高，越強，由此可見，姜黃素產(chǎn)生 ROS 呈濃度依賴性（如圖 1）。

圖 2. 25 μM 姜黃素處理后熒光強度值與時間的關(guān)系黃素介導 PDT 對 MRSA 浮游菌的殺傷通過稀釋平板法（如圖 3），顯示單純 PDT 組、不同劑量姜黃素組和空白對照RSA 浮游菌存活率均無明顯差異（P＞0.05）。姜黃素-PDT 組的 MRSA 存活于空白對照組、PDT 組和姜黃素組，，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。如表 1姜黃素濃度為 1 μM 時，MRSA 浮游菌存活率為（95.62±1.24）%（P＜0.05）RSA 浮游菌殺傷作用微弱；姜黃素濃度升至 12.5 μM 時，MRSA 浮游菌存活43.42±1.71）%（P＜0.01），殺傷作用明顯增強；姜黃素濃度至 25 μM 時，僅為（0.38±0.32）%（P＜0.01），對 MRSA 浮游菌的殺傷作用達 99%以上。見，姜黃素介導 PDT 對 MRSA 浮游菌有濃度依賴性的殺傷抑制作用。

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10 仇s

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