【摘要】：抗生素的濫用引發(fā)細菌耐藥性激增,嚴重威脅人類健康。因此,新型抗生素藥物亟待開發(fā)�？咕�(Antimicrobial peptides)是一種短肽,是宿主先天性免疫防御病原體的第一道防線,具有廣譜抑菌作用,有望成為傳統(tǒng)抗生素的替代物。本研究利用畢赤酵母(Pichia pastoris)真核表達系統(tǒng)對家蠅(Musca domestica)抗菌肽Domesticin和日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)抗菌肽MnALF4進行了重組表達,并對兩種抗菌肽的抑菌活性和抑菌機制進行了研究。首先構(gòu)建了重組表達載體pPIC9K-domesticin和pPIC9K-MnALF4,分別將它們電擊轉(zhuǎn)化入KM71酵母感受態(tài)細胞中。甲醇誘導培養(yǎng)后利用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot對表達產(chǎn)物進行檢測,并用鎳柱親和層析對表達產(chǎn)物進行純化。對純化后的重組蛋白Domesticin和MnALF4分別進行抑菌和溶血活性檢測;利用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察Domesticin和MnALF4對大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)形態(tài)的影響,以此研究Domesticin和MnALF4的抑菌機制。實驗結(jié)果顯示,Domesticin及MnALF4在畢赤酵母中成功表達,其大小分別為5.4 kD及12 kD。Domesticin及MnALF4對痢疾菌(Dysentery bacillus)等致病菌在內(nèi)的22種細菌都有顯著抑菌作用。掃描電鏡觀察到Domesticin可破壞細菌細胞膜,促使細菌皺縮溶解最終死亡;MnALF4可破壞細菌細胞壁,使桿狀細菌變?yōu)榍驙畹脑|(zhì)體,進而溶解破碎導致細菌死亡,同時也可以破壞細菌細胞膜,使內(nèi)容物外流從而殺死細菌。溶血活性實驗表明Domesticin及MnALF4對動物細胞的溶血率低于2%。綜上所述,Domesticin主要通過作用于細胞膜,改變細胞膜通透性使細胞完整性喪失,導致細菌死亡。MnALF4以細胞壁及細胞膜為共同靶點,發(fā)揮抑菌作用。Domesticin及MnALF4的廣譜抑菌作用及低溶血率表明其有望成為新型抗菌劑。
【圖文】：

蠅 domesticin 基因 PCR 子量；1：家蠅 domesticesis of Musca domestica do: Musca domestica domesti pMD-19T-domestic因與 pMD-19T 連接后隆，如圖 3-2（A）所示條帶出現(xiàn)，而以水為�？寺≥d體 pMD-19T-dopMD-19T-domesticin 經(jīng)符，另一條帶大小與 p

T-domesticin 的菌落 PCR陽性克��；11：陰性對in 質(zhì)粒雙酶切；2：pMDloned vector pMD-19T-doker ;1~10: positive clone;D-19T-domesticin plasmdomesticin 表達載體domesticin 基因及 p抗菌肽表達載體 pPI如圖 3-3 所示，雙酶切小與 domesticin 基因化質(zhì)粒。將構(gòu)建的表mesticin 基因與 pPIC
【學位授予單位】：河北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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