【摘要】：目的干眼(dry eye,DE)屬于最常見眼表疾病。研究發(fā)現(xiàn),干眼的致病因素有很多,包括:年齡、飲食、戴隱形眼鏡、環(huán)境污染以及過度用眼等。在臨床上干眼的治療藥物有很多種,其中主要是利用人工淚液來潤滑和保濕眼表,進(jìn)而來改善和緩解癥狀。然而,近些年達(dá)成的共識是非感染性的免疫性炎癥在干眼的致病過程中起到?jīng)Q定性作用。但是由于臨床上并沒有合適治療干眼免疫性炎癥的藥物,所以找到一種合理的治療藥物迫在眉睫。他克莫司(Tacrolimus,FK506)是一種免疫抑制的新型藥物。研究表明,生理狀態(tài)下他克莫司能夠阻止T細(xì)胞核脫磷酸。這一作用從根本上抑制了淋巴細(xì)胞因子的生成,從而阻止炎癥因子的釋放,起到調(diào)節(jié)免疫的作用。由于他克莫司屬于疏水性藥物,生物利用度低,因此構(gòu)建他克莫司納米晶聯(lián)合人工淚液的給藥體系有望解決以上問題。本研究擬首先通過超聲和重結(jié)晶方法獲得他克莫司納米晶,然后利用層層自組裝(LbL)技術(shù)在他克莫司納米藥物表面修飾人工淚液(羧甲基纖維素鈉,CMC)。從而達(dá)到保濕、免疫調(diào)節(jié)的聯(lián)合作用治療干眼,提高藥物療效和改善患者用藥的依從性。方法1.首先利用超聲法和重結(jié)晶法制備出尺寸、形狀可控的藥物晶體,然后進(jìn)一步摸索超聲法的超聲時間,重結(jié)晶法探討滴藥速率、勻漿轉(zhuǎn)速、以及穩(wěn)定劑等因素對他克莫司納米晶形成的影響。最后,通過掃描、透射電子顯微鏡等表征他克莫司納米晶。2.殼層材料為人工淚液羧甲基纖維素鈉(CMC)和聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)。利用層層自組裝技術(shù),將CMC負(fù)載在納米級別的他克莫司顆粒。LbL方法通常是將殼層材料通過靜電力等弱相互作用力沉積到他克莫司晶體表面,制備他克莫司復(fù)合納米晶的過程中既無其他有機(jī)試劑參與又在常溫穩(wěn)定的條件下,保證在制備的藥物過程中對藥物本身無影響。3.將人的角膜上皮細(xì)胞(HCEs)培養(yǎng)到生長期,考察各種條件下細(xì)胞對藥物的攝取作用�？疾燧d藥的FK506-(PAH/CMC)_3納米粒子,不同形態(tài)、不同尺寸對角膜上皮細(xì)胞吸收的影響。4.藥物毒性實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)人的角膜上皮細(xì)胞,待細(xì)胞完全貼壁后加入不同質(zhì)量濃度(0.2、0.5、1、1.5、2mg/ml)的復(fù)合納米顆粒FK506-(PAH/CMC)_3。兩者共同孵育4小時后,加入CCK8檢測液,測定各組的細(xì)胞活性率均與空白對照組比較。結(jié)果1.本實(shí)驗(yàn)通過兩種不同的方法制備他克莫司納米晶。超聲法顯示超聲時間越長他克莫司晶的長徑比越趨近于1,藥物晶體接近于球形。但超聲法制備的納米晶均一性不如重結(jié)晶法制備的納米晶優(yōu)良。通過重結(jié)晶法可以得到針狀和規(guī)則六邊形等不同形態(tài)的他克莫司晶體。影響重結(jié)晶法制備的他克莫司納米晶形成的因素包括:注射泵藥物滴速、勻漿的轉(zhuǎn)速、以及穩(wěn)定劑的選擇。2.通過LbL法對他克莫司納米晶表面修飾,利用正負(fù)電荷之間的相互作用,將表面帶正電荷的PAH與顯負(fù)電荷的人工淚液逐層沉積于藥物晶體表面。既可實(shí)現(xiàn)改善藥物的親疏水性、提高疏水藥物溶解性,也實(shí)現(xiàn)了人工淚液對他克莫司免疫抑制劑的潤滑功能修飾,起到聯(lián)合給藥作用,減少用藥刺激并治療中重度干眼的免疫炎癥。3.通過染色不同尺寸的他克莫司納米晶,發(fā)現(xiàn)尺寸較大的藥物不易被細(xì)胞攝取。而且超聲法制備的他克莫司微晶仍尚不均一,仍有一部分藥物被阻攔在細(xì)胞外。反之重結(jié)晶方法優(yōu)化出的納米晶大部分被人角膜上皮細(xì)胞吸收,這也和藥物的尺寸有關(guān)系。4.通過各個不同濃度的他克莫司復(fù)合納米晶FK506-(PAH/CMC)_3,在人角膜上皮細(xì)胞上的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)的分析。證明他克莫司復(fù)合納米晶FK506-(PAH/CMC)_3對角膜上皮細(xì)胞基本沒有毒性。結(jié)論超聲法發(fā)現(xiàn),超聲時間越長他克莫司晶的長徑比越趨近于1,藥物晶體更接近于球形。但超聲結(jié)晶法制備的納米晶均一性不如重結(jié)晶法制備的納米晶優(yōu)良。重結(jié)晶法制備片狀規(guī)則他克莫司納米晶,重結(jié)晶法的注射泵滴速、勻漿的轉(zhuǎn)速、以及穩(wěn)定劑的選擇都可以影響他克莫司納米晶形態(tài)的形成。而且制備的他克莫司納米晶與原料藥對比晶型并未發(fā)生改變。他克莫司納米藥物表面成功修飾羧甲基纖維素鈉人工淚液,二者起到潤滑功能和免疫抑制的聯(lián)合作用。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)說明,在臨床藥物濃度范圍內(nèi),他克莫司對眼表沒有毒性。角膜上皮細(xì)胞對尺寸較小的他克莫司納米晶具有攝取作用。藥物晶體的尺寸和形態(tài)可能對細(xì)胞攝取有影響。
【圖文】：

將原料藥物粉末充分研磨，放入 X 射線衍射儀檢測器中進(jìn)行掃描，獲得XRD 圖譜。測定條件為常溫，石墨單色器，掃描速度 6°/min，2θ掃描范圍 3°~60°，，掃描間隔 0.02°電壓 40 kV，電流 200 mA，λ（CuKa1）=1.5405 ，采用 CuKa1 輻射。以上數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 5 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。1.1.9 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由于納米晶體的形狀不屬于球形，所以不能利用馬爾文粒徑分析儀測定。采用 nanomeasure 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.2 結(jié)果1.2.1 超聲法他克莫司的表征X 射線衍射，（X-ray diffraction，XRD）。通過（圖 1a）分析他克莫司原料的衍射圖譜，他克莫司的特征峰很尖銳，說明他克莫司具有良好的結(jié)晶性并且結(jié)晶度非常高。(圖 1b)是已經(jīng)上市在臨床中使用的日本千壽生產(chǎn)的 0.1%他克莫司滴眼液藥物，可以看到藥物大小不均一，尺寸較大（16.1±4.2μm），表面有輔料覆蓋。

如（圖2e）所示，較大尺寸的藥物納米晶被篩除后，剩余尺寸較小的他克莫司納米晶，其分散性較為良好。圖 2 在其他條件相同情況下，超聲時間改變他克莫司晶體掃描電鏡照片(a)0min；(b)12min；(c)24min；(d)32min；(e) 24min 后，800 目細(xì)胞篩篩選利用 Nanomeasure 軟件統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，如（圖 3a）所示，隨著超聲時間延長，納米晶的粒徑逐漸減小。但 24min 后，粒徑的變化不再明顯。（圖 3b）顯示隨著超聲時間的增加，藥物的長徑比(AR)逐漸降低且趨向于 1
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2711586