【摘要】：目的:17-乙炔基雄甾-5-烯-3,17-二醇(EAD),由5-雄甾烯二醇(5-AED)于17位碳引入乙炔基得到。EAD相較于5-AED具有更好的抗放射活性。目前本研究擬建立生物基質(zhì)中EAD的定量分析方法并考察其臨床前體內(nèi)藥動學(xué)特征,為后續(xù)藥物設(shè)計(jì)與申報(bào)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。HYD-PEP06是以首個血管內(nèi)皮抑素抗癌藥物-恩度(Endostar)為基礎(chǔ),利用固相合成法合成的30個氨基酸組成的多肽。目前擬申報(bào)生物藥注冊分類1.1類新藥。因此,本研究擬考察其臨床前體內(nèi)藥代動力學(xué)特征,為此多肽的申報(bào)以及進(jìn)一步臨床試驗(yàn)人體的藥代動力學(xué)研究提供數(shù)據(jù)支持與參考。方法:采用液質(zhì)聯(lián)用定量分析方法,分別完成兩種藥物的質(zhì)譜方法的建立與優(yōu)化,液相方法的建立與優(yōu)化。完成生物樣品中甾體激素EAD和多肽HYD-PEP06定量分析方法的建立與完整的方法學(xué)驗(yàn)證。應(yīng)用完整驗(yàn)證的定量方法完成EAD和HYD-PEP06的臨床前體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。結(jié)果:1.測定生物樣品中EAD含量的LC-MS/MS定量分析方法的建立與確證建立并確證了測定大鼠血漿中抗ARS甾體激素藥物EAD濃度的HPLC-MS/MS方法,此方法簡單、靈敏、專屬性強(qiáng),無基質(zhì)效應(yīng)。大鼠血漿中,EAD在5~1000 ng·mL~(-1)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R0.99),定量下限為5 ng·mL~(-1)。生物樣品前處理采用沉淀蛋白的方法。EAD的批內(nèi)RSD為4.35%~12.69%,批間RSD為4.38%~13.89%,RE%為-6.48%~0.01%。絕對回收率為81.54%~88.85%,方法無基質(zhì)效應(yīng)、無殘留效應(yīng)。甾體激素EAD儲備液4℃放置7天穩(wěn)定;血漿樣本室溫放置6h、-20℃放置7天、-20℃反復(fù)凍融3次穩(wěn)定。處理后樣品進(jìn)樣倉(4℃)放置24h穩(wěn)定性良好。該分析方法能夠滿足EAD臨床前大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究要求。2.大鼠單劑量口服灌胃給藥甾體激素EAD后的藥代動力學(xué)研究采用經(jīng)過確證的LC-MS/MS方法測定Wistar大鼠單劑量口服灌胃給藥EAD(100 mg·kg~(-1))后EAD的血藥濃度,血漿中的藥物具有明顯的吸收、消除過程。用WinNonlin 6.4,非房室模型計(jì)算動力學(xué)參數(shù)。T_(max)為2h,即EAD口服給藥后2h藥物吸收達(dá)峰。藥時曲線下面積AUC為(178.03±71.72)h·ng·mL~(-1),消除半衰期T_(1/2)為(2.15±0.87)h,平均血漿清除率CL為(527.49±207.55)L·h~(-1)·kg~(-1),表觀分布容積V_z為(1590.79±702.88)L·kg~(-1)。同時,數(shù)據(jù)表明,在給藥后8-12h內(nèi)出現(xiàn)跳點(diǎn),即EAD的吸收可能存在雙吸收的現(xiàn)象。初步推測,EAD在大鼠體內(nèi)可能存在腸肝循環(huán)。另根據(jù)藥物的血藥濃度來看,100 mg·kg~(-1)的EAD口服灌胃給藥后,體內(nèi)血藥濃度非常低,平均最高濃度為(28.92±6.02)ng·mL~(-1),給藥后12h后血漿中基本檢測不到原型藥物EAD。3.測定生物樣品中HYD-PEP06含量的LC-MS/MS定量分析方法的建立與確證本文分別建立并確證了測定大鼠全血中HYD-PEP06含量的LC-MS/MS定量分析方法,此方法簡單、靈敏、專屬性強(qiáng)。經(jīng)考察,此多肽無物理吸附效應(yīng)。通過在流動相及洗針液中加入甲酸可以有效去除殘留效應(yīng)并且提高響應(yīng)。通過對酸、抗氧化劑、酶抑制劑及樣品處理溫度——室溫/冰浴等影響HYD-PEP06溶液及全血中穩(wěn)定性條件的考察,確定了HYD-PEP06儲備液中加酸,冰浴上完成生物樣品前處理的實(shí)驗(yàn)條件。生物樣品前處理采用沉淀蛋白的方法。大鼠全血中,HYD-PEP06在10~2000 ng·mL~(-1)范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R0.99)。HYD-PEP06的批內(nèi)RSD為4.81%~9.42%,批間RSD為3.13%~4.87%,RE%為-5.06%~8.54%。絕對回收率為57.35%~61.41%,本方法無基質(zhì)效應(yīng)、無稀釋效應(yīng)。多肽HYD-PEP06及內(nèi)標(biāo)儲備液、工作液在室溫放置5h穩(wěn)定性良好,樣品處理過程中在冰浴上30min之內(nèi)穩(wěn)定,處理后樣品在-80℃放置2月、4℃放置2周、進(jìn)樣倉(4℃)放置48h穩(wěn)定性良好。該分析方法能夠滿足HYD-PEP06臨床前藥代動力學(xué)研究。4.Wistar大鼠靜脈注射HYD-PEP06后的藥代動力學(xué)研究大鼠靜脈注射HYD-PEP06注射液后,其代謝動力學(xué)特征如下:給藥劑量為3.3,30,90 mg·kg~(-1),給藥劑量比例為1:9:27,AUC_(last)分別為(702.63±126.47)h·ng·mL~(-1),(7932.19±3606.62)h·ng·mL~(-1),(21104.82±4396.20)h·ng·mL~(-1),其AUC比值為1:11.3:30,與給藥劑量之比基本呈比例正相關(guān)增加。由上述結(jié)果推測,在3.3~90 mg·kg~(-1)劑量測試范圍內(nèi),HYD-PEP06在Wistar大鼠體內(nèi)基本呈線性動力學(xué)特征。低、中、高劑量給藥后首個采血點(diǎn)1min即為血藥濃度C_(max)分別是(11252.5±1607.4)ng·mL~(-1),(126987.5±45697.2)ng·mL~(-1),(442125.0±96828.9)ng·mL~(-1),半衰期T_(1/2)分別為(1.35±0.07)min,(2.84±0.10)min,(8.10±1.00)min,因?yàn)楸径嚯南俣容^快,低中高劑量組檢測到的血藥濃度時間點(diǎn)不同,計(jì)算半衰期T_(1/2)采用的時間點(diǎn)不同,導(dǎo)致的低、中、高劑量半衰期T_(1/2)的差別沒有生物學(xué)意義。5.Wistar大鼠皮下注射HYD-PEP06后的藥代動力學(xué)研究大鼠皮下注射HYD-PEP06后,其代謝動力學(xué)特征如下:給藥劑量為30 mg·kg~(-1),給藥后5min藥物在體內(nèi)吸收達(dá)峰,即為血藥濃度C_(max)是(780.4±392.1)ng·mL~(-1),AUC_(last)為(249.58±74.83)h·ng·mL~(-1),半衰期T_(1/2)為(9.82±2.32)min。與同劑量靜脈給藥相比,其絕對生物利用度為3.15%±0.94%。結(jié)論:1.本研究建立的定量分析方法能夠滿足EAD臨床前大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究要求。初步推測,EAD在大鼠體內(nèi)可能存在腸肝循環(huán)。另根據(jù)藥物的血藥濃度來看,100 mg·kg~(-1)的EAD口服灌胃給藥后,體內(nèi)血藥濃度低,給藥后12h后血漿中基本檢測不到原型藥物EAD。2.本研究建立的定量分析方法能夠滿足HYD-PEP06臨床前藥代動力學(xué)研究。在3.3~90 mg·kg~(-1)劑量測試范圍內(nèi),HYD-PEP06在Wistar大鼠體內(nèi)基本呈線性動力學(xué)特征。大鼠皮下注射HYD-PEP06后,與同劑量靜脈給藥相比,其絕對生物利用度為3.15%±0.94%。
【圖文】：

部分 測定生物樣品中 EAD 含量的液質(zhì)聯(lián)用分析的建立與驗(yàn)證首次建立并確證測定生物樣品中甾體激素類藥物 EAD 濃度的-MS/MS 定量分析方法，根據(jù)原國家藥品監(jiān)督管理局 2014 年頒學(xué)藥品臨床前藥代動力學(xué)研究指導(dǎo)原則ǐ及 2015 年版ǎ中國藥關(guān)內(nèi)容，開展 HPLC-MS/MS 方法學(xué)確證，為研究 EAD 臨床前藥研究提供技術(shù)條件 內(nèi)標(biāo)選用結(jié)構(gòu)相似的甾體激素類藥物 5-AE

（A）、LLOQ樣本（B）、大鼠口服灌胃給藥后2h血漿樣hromatograms of blank plasma sample, blank plasma sample spa sample from Wistar rat 2.0 h after oral administration of EAD (B) and (C).定量下限血漿100 μL分別依次加入一系列濃度梯度的度為 5，25，50，100，，250，500，1000 ng .6 血漿樣品前處理方法操作 橫坐標(biāo)為血漿中與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比，以加權(quán)最小二乘法（直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 表 1-3 列析方法測定 3 個分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線及參數(shù)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R969.1

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本文編號：2708229