【摘要】：多巴胺能(dopaminergic neurons,DA)神經元是中樞神經系統中具有重要生理功能的一類神經元。它通過合成和分泌多巴胺參與隨意運動的調控、動機的形成以及情緒行為的調節(jié)。對DA神經元發(fā)育過程的深入研究將有助于帕金森病等相關神經系統疾病的診斷與治療。DA神經元的發(fā)育過程接受精確的時空轉錄調控。研究顯示,表觀遺傳修飾參與調控DA神經元發(fā)育。組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化修飾(H3K27me3)是一類發(fā)揮轉錄抑制作用的表觀遺傳修飾。早期研究表明,H3K27me3在DA神經元分化成熟以及維持過程中發(fā)揮重要調控作用。在中腦發(fā)育早期,敲除組蛋白甲基轉移酶Ezh2使H3K27me3水平下調,導致中腦發(fā)育異常并影響DA神經元發(fā)育。Ezh2是多梳抑制復合物2(PRC2)中發(fā)揮甲基轉移酶活性的核心成員,它通過SET區(qū)域催化H3K27me3。不同于在發(fā)育早期敲除Ezh2,敲減成年大鼠組蛋白去甲基化酶Jmjd3促使H3K27me3水平升高,導致M1型小膠質細胞增多,給予MPTP刺激后,Jmjd3敲減組中腦DA神經元數量顯著少于對照組。由此可見,H3K27me3水平對中腦和DA神經元在不同發(fā)育時期出現了不同的調控作用。此外,體外培養(yǎng)的中腦源神經干細胞(ventral midbrain derived neural stem cells,VM-NSCs)在分化過程中H3K27me3水平逐漸升高�？箟难帷V譜組蛋白去乙�；敢种苿〢pcidin等化合物通過促進Jmjd3表達而抑制H3K27me3水平,從而促進VM-NSCs向DA神經元分化。綜上所述,H3K27me3以及Ezh2是否在DA神經元發(fā)育過程中發(fā)揮調控作用目前仍需探討。借助于VM-NSCs體外分化過程,我們探究了H3K27me3調節(jié)DA神經元分化的作用及其機制。研究發(fā)現,VM-NSCs分化過程中Jmjd3和UTX表達下調介導H3K27me3水平升高,而組蛋白甲基轉移酶Ezh2的表達水平沒有明顯變化。利用Jmjd3和UTX抑制劑GSK-J1處理VM-NSCs促使H3K27me3水平上升,導致VM-NSCs向DA神經元分化減少。相反,Ezh2選擇性抑制劑EPZ005687使VM-NSCs分化過程中H3K27me3水平的上升受到抑制,VMNSCs向DA神經元分化增多。此外,抑制Ezh2活性使VM-NSCs的增殖能力下降并促進VM-NSCs向DA神經前體細胞分化。EPZ005687對VM-NSCs向神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、膽堿能神經元以及GABA能神經元分化的潛能沒有顯著影響。進一步研究發(fā)現,FoxA2,Nurr1,Lmx1a,Pitx3等與DA神經元發(fā)育密切相關的轉錄因子的mRNA水平均顯著上升。ChIP實驗證實,EPZ005687促使相關基因啟動子區(qū)H3K27me3的占駐水平下降。其中,Nurr1是調控多巴胺能神經元分化成熟的關鍵性因子。干擾Nurr1表達抑制VM-NSCs向DA神經元分化,并且抑制Ezh2活性介導的促進VM-NSCs向DA神經元分化的效應也被阻遏,提示了Nurr1在該過程中發(fā)揮重要作用。中腦發(fā)育過程中,Ezh2表達減少導致H3K27me3水平下調。借助于腺相關病毒載體干擾Ezh2在胚胎期(E)11天中腦的表達,促使H3K27me3水平下調,并促進中腦腹側區(qū)域DA神經元分化增多。在E11過表達Ezh2促進中腦區(qū)域細胞增殖能力,不影響中腦區(qū)域DA神經元的分化成熟。以上結果表明,高水平的H3K27me3抑制VM-NSCs向DA神經元分化的潛能。抑制或降低Ezh2表達能夠促進VM-NSCs以及體內中腦區(qū)域細胞向DA神經元分化。成體神經干細胞是成年動物中樞神經系統內具有自我更新能力并能夠向神經元和膠質細胞分化的一類干細胞。目前對于Ezh2調控成體神經干細胞增殖與分化的作用仍缺乏了解。對來源于海馬的神經干細胞(NSCs)給予EPZ005687處理,檢測抑制Ezh2對NSCs的增殖和分化的影響。結果顯示,低濃度的EPZ005687促進NSCs增殖并向神經元分化,而高濃度的EPZ005687促進NSCs凋亡。利用EPZ005687處理成年C57BL/6小鼠,促進SVZ和DG區(qū)神經發(fā)生。體外實驗進一步證實,抑制Wnt/β-catenin通路阻遏EPZ005687促進NSCs向神經元分化,而不影響其促進增殖的作用。拮抗Wnt5a不影響EPZ005687促進NSCs向神經元分化,而抑制EPZ005687促進NSCs的增殖作用。以上結果提示,Ezh2在干細胞神經發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,且Wnt/β-catenin信號通路以及Wnt5a分別在抑制Ezh2介導的NSCs分化和增殖過程中具有調控作用。
【圖文】：

圖 1 DA 神經元分布區(qū)域及投射區(qū)域[5]（A）A8(藍色區(qū)域)：紅核后區(qū)；A9（紅色區(qū)域）：黑質；A10（紅色區(qū)域）：腹側背蓋區(qū)；（B）DA 神經元投射區(qū)域。Fig.1 Distribution of DAneurons and their projectins in the adult midbrain. （A）Distribution of DAneurons in adult midbrain.A8(blue), retrorubral;A9(red),substantial nigra;A10(yellow), , ventral tegmental area; （B）The projection area of DAneurons.ACC, anteriorcingulate cortex; CNA, central nucleus of the amygdala; DS, dorsal striatum; ERC, entorhinalcortex; H, habenula; HC, hippocampus; LC, locus coeruleus; LS, lateral septum; NA, nucleusaccumbens; OT, olfactory tubercle; PFC, prefrontal cortex; PRC, perirhinal cortex; PC,pyriformcortex.1.2 DA 神經元生理功能

Ezh2 調控多巴胺能神經元發(fā)育及成體神經干細胞神經發(fā)生的相關機制研究術，發(fā)現 D4 受體的 mRNA 主要在前額葉皮層、杏仁核以及中腦等區(qū)域高表達。D4 受體激動后能夠抑制胞內 cAMP 聚集，抑制自主運動。D4 受體突變小鼠出現功能受損，說明 D4 受體與隨意運動的調控密切相關[10]。DA 神經元通過投射區(qū)域的多巴胺受體發(fā)揮重要生理功能，而對 DA 神經元發(fā)育過程的研究有助于了解 DA 神經元功能并裨益相關疾病的治療。1.3DA 神經元發(fā)育1.3.1 DA 神經元發(fā)育中腦 DA 神經元起源于中腦腹側，，整個發(fā)育過程接受精確的時空轉錄調控。大鼠的 DA 神經前體細胞大約在胚胎期（Embryonic， E）第 8 天起源于神經管腹側與底板的交界處，其發(fā)生過程與中腦發(fā)育過程密不可分。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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3 李s

本文編號：2707889