【摘要】：高血脂癥是指高膽固醇、高甘油三酯、極低密度脂蛋白增高和高密度脂蛋白降低的脂蛋白代謝異常性疾病。多項臨床調(diào)查證明,高血脂是導(dǎo)致動脈粥樣硬化癥以及冠心病等心腦血管疾病的危險因素。因此,降血脂藥物的使用,被認為是防治心腦血管疾病的重要且有效的途徑。盡管目前臨床上存在多種類型的降血脂藥物,但因為藥物的毒副作用以及患者的個體差異,使心腦血管病的發(fā)病率仍然居高不下,因此開發(fā)新型降膽固醇藥物仍然是研發(fā)新藥領(lǐng)域的重點。人體內(nèi)膽固醇的來源有兩種方式,外源性攝入膽固醇和內(nèi)源性生物合成的膽固醇,其中內(nèi)源性合成途徑為主要方式,因此通過靶向膽固醇的內(nèi)源性合成途徑能夠有效的控制膽固醇水平。DHCR24是膽固醇合成途徑中最后一步的催化酶,負責(zé)將膽甾醇還原為膽固醇。DHCR24基因敲除小鼠來源的胚胎纖維細胞的膽固醇濃度顯著降低,暗示DHCR24可以作為降膽固醇藥物新靶點從而發(fā)揮其下調(diào)膽固醇的作用。為了探究以DHCR24為靶點開發(fā)新型降膽固醇藥物的可能性,我們利用實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的四種靶向DHCR24基因的重組腺病毒干擾載體Ad-siDHCR24,研究其干擾靶基因DHCR24表達的效率,并探討其在細胞和動物水平降低膽固醇的效果。為了檢驗四種針對不同干擾靶點的Ad-siDHCR24干擾DHCR24基因表達的效率,我們將其分別感染或四種等比例混合(Mix)后感染至人肝臟細胞株HepG2細胞。實時定量熒光PCR結(jié)果顯示No.1、No.3、No.4和Mix組的Ad-siDHCR24能夠顯著下調(diào)DHCR24 mRNA的表達水平,Western Blotting實驗也表明Mix組Ad-siDHCR24能夠高效的干擾DHCR24蛋白水平的表達。這些結(jié)果證明實驗室前期構(gòu)建的Ad-siDHCR24以等比例混合使用能夠減少siRNA對于靶基因的脫靶作用,更顯著降低DHCR24的mRNA和蛋白水平的表達水平,有效發(fā)揮沉默DHCR24基因表達的作用。為了進一步探究重組腺病毒Ad-siDHCR24在細胞水平的降膽固醇效果,我們將感染重組腺病毒混合液(Ad-siDHCR24 Mix)的HepG2細胞進行了膽固醇熒光染色劑非律平的細胞染色。結(jié)果顯示,與對照組相比,感染了Ad-siDHCR24 Mix細胞的藍色熒光強度顯著減弱,暗示Ad-siDHCR24 Mix重組腺病毒能夠通過顯著降低細胞內(nèi)膽固醇的水平。進一步利用利用高效液相色譜法檢測細胞內(nèi)膽固醇和其前體膽甾醇的水平。實驗結(jié)果表明,感染Ad-siDHCR24 Mix組細胞的膽固醇水平與對照組相比顯著降低,這與細胞膽固醇熒光染色法結(jié)果一致。這些結(jié)果證明Ad-siDHCR24 Mix通過沉默靶基因DHCR24的表達而發(fā)揮了降低膽固醇生物合成的作用。最后,我們研究了Ad-siDHCR24 Mix在動物水平對膽固醇含量的影響。我們使用高脂飼料飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠,成功建立高血脂模型,通過尾靜脈注射AdsiDHCR24 Mix腺病毒(藥物組),進行肝臟組織的HE染色分析以及血液生化指標分析,用以確定降膽固醇效果。HE染色結(jié)果表明,與高血脂模型組的對照組相比,Ad-siDHCR24 Mix的小鼠肝臟組織細胞變小,所含脂質(zhì)變少,空泡化水平顯著降低。同時血液生化指標檢測的結(jié)果表明藥物組小鼠血清中膽固醇、甘油三脂以及低密度脂蛋白固醇水平均呈現(xiàn)出顯著性下降,并伴隨著高密度脂蛋白固醇的升高。以上結(jié)果證明,Ad-siDHCR24 Mix可以在動物水平成功實現(xiàn)降血脂效果。綜上所述,本研究通過對重組腺病毒干擾載體Ad-siDHCR24降膽固醇效果的初步藥效學(xué)研究,證明了Ad-siDHCR24 Mix能夠通過干擾DHCR24的表達,實現(xiàn)降低血脂的效果。本研究證明DHCR24可以作為降血脂藥物的新靶點,從而為開發(fā)新型抗心血管疾病藥物提供了新的思路和理論依據(jù)。
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圖 0-2 膽固醇的流出圖(Frederick R,et al. [J] Nature, 2005)物已經(jīng)進化出復(fù)雜而精確的機制以保持細胞內(nèi)膽固醇維持在內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)遭到破壞時后果是非常嚴重的，會導(dǎo)致疾病化，因此膽固醇穩(wěn)態(tài)對于維持人體健康來說非常重要6。

0-1 細胞內(nèi)源性膽固醇合成（EserJ.Zerenturk,etal.[J]progressinLipidResear此外，細胞還可以通過控制膽固醇流出的方式來調(diào)控。多重跨膜蛋白P-binding cassette transporter A1, ABCA1）促進細胞中磷脂向脂質(zhì)缺白 A-I（ApolipoproteinA-I, ApoA-I）轉(zhuǎn)移，，通過膽固醇�；D(zhuǎn)移酶-I 顆粒轉(zhuǎn)化為血液中的高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HD 與肝細胞中的清道夫受體 B1（scavengerreceptor-B1,SR-B1）結(jié)合，膽固醇酯轉(zhuǎn)移至肝臟，從而轉(zhuǎn)化為膽汁鹽排出體外[10]。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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1 吳宇迪;;雙重降膽固醇新藥療效尚未定[J];心血管病防治知識;2008年05期

2 王鄭昊;陸國平;陳楨s

本文編號：2705605