【摘要】：高血脂癥是指高膽固醇、高甘油三酯、極低密度脂蛋白增高和高密度脂蛋白降低的脂蛋白代謝異常性疾病。多項(xiàng)臨床調(diào)查證明,高血脂是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化癥以及冠心病等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。因此,降血脂藥物的使用,被認(rèn)為是防治心腦血管疾病的重要且有效的途徑。盡管目前臨床上存在多種類型的降血脂藥物,但因?yàn)樗幬锏亩靖弊饔靡约盎颊叩膫�(gè)體差異,使心腦血管病的發(fā)病率仍然居高不下,因此開發(fā)新型降膽固醇藥物仍然是研發(fā)新藥領(lǐng)域的重點(diǎn)。人體內(nèi)膽固醇的來(lái)源有兩種方式,外源性攝入膽固醇和內(nèi)源性生物合成的膽固醇,其中內(nèi)源性合成途徑為主要方式,因此通過靶向膽固醇的內(nèi)源性合成途徑能夠有效的控制膽固醇水平。DHCR24是膽固醇合成途徑中最后一步的催化酶,負(fù)責(zé)將膽甾醇還原為膽固醇。DHCR24基因敲除小鼠來(lái)源的胚胎纖維細(xì)胞的膽固醇濃度顯著降低,暗示DHCR24可以作為降膽固醇藥物新靶點(diǎn)從而發(fā)揮其下調(diào)膽固醇的作用。為了探究以DHCR24為靶點(diǎn)開發(fā)新型降膽固醇藥物的可能性,我們利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的四種靶向DHCR24基因的重組腺病毒干擾載體Ad-siDHCR24,研究其干擾靶基因DHCR24表達(dá)的效率,并探討其在細(xì)胞和動(dòng)物水平降低膽固醇的效果。為了檢驗(yàn)四種針對(duì)不同干擾靶點(diǎn)的Ad-siDHCR24干擾DHCR24基因表達(dá)的效率,我們將其分別感染或四種等比例混合(Mix)后感染至人肝臟細(xì)胞株HepG2細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果顯示No.1、No.3、No.4和Mix組的Ad-siDHCR24能夠顯著下調(diào)DHCR24 mRNA的表達(dá)水平,Western Blotting實(shí)驗(yàn)也表明Mix組Ad-siDHCR24能夠高效的干擾DHCR24蛋白水平的表達(dá)。這些結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的Ad-siDHCR24以等比例混合使用能夠減少siRNA對(duì)于靶基因的脫靶作用,更顯著降低DHCR24的mRNA和蛋白水平的表達(dá)水平,有效發(fā)揮沉默DHCR24基因表達(dá)的作用。為了進(jìn)一步探究重組腺病毒Ad-siDHCR24在細(xì)胞水平的降膽固醇效果,我們將感染重組腺病毒混合液(Ad-siDHCR24 Mix)的HepG2細(xì)胞進(jìn)行了膽固醇熒光染色劑非律平的細(xì)胞染色。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,感染了Ad-siDHCR24 Mix細(xì)胞的藍(lán)色熒光強(qiáng)度顯著減弱,暗示Ad-siDHCR24 Mix重組腺病毒能夠通過顯著降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇的水平。進(jìn)一步利用利用高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和其前體膽甾醇的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,感染Ad-siDHCR24 Mix組細(xì)胞的膽固醇水平與對(duì)照組相比顯著降低,這與細(xì)胞膽固醇熒光染色法結(jié)果一致。這些結(jié)果證明Ad-siDHCR24 Mix通過沉默靶基因DHCR24的表達(dá)而發(fā)揮了降低膽固醇生物合成的作用。最后,我們研究了Ad-siDHCR24 Mix在動(dòng)物水平對(duì)膽固醇含量的影響。我們使用高脂飼料飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠,成功建立高血脂模型,通過尾靜脈注射AdsiDHCR24 Mix腺病毒(藥物組),進(jìn)行肝臟組織的HE染色分析以及血液生化指標(biāo)分析,用以確定降膽固醇效果。HE染色結(jié)果表明,與高血脂模型組的對(duì)照組相比,Ad-siDHCR24 Mix的小鼠肝臟組織細(xì)胞變小,所含脂質(zhì)變少,空泡化水平顯著降低。同時(shí)血液生化指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果表明藥物組小鼠血清中膽固醇、甘油三脂以及低密度脂蛋白固醇水平均呈現(xiàn)出顯著性下降,并伴隨著高密度脂蛋白固醇的升高。以上結(jié)果證明,Ad-siDHCR24 Mix可以在動(dòng)物水平成功實(shí)現(xiàn)降血脂效果。綜上所述,本研究通過對(duì)重組腺病毒干擾載體Ad-siDHCR24降膽固醇效果的初步藥效學(xué)研究,證明了Ad-siDHCR24 Mix能夠通過干擾DHCR24的表達(dá),實(shí)現(xiàn)降低血脂的效果。本研究證明DHCR24可以作為降血脂藥物的新靶點(diǎn),從而為開發(fā)新型抗心血管疾病藥物提供了新的思路和理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 0-2 膽固醇的流出圖(Frederick R,et al. [J] Nature, 2005)物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜而精確的機(jī)制以保持細(xì)胞內(nèi)膽固醇維持在內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)遭到破壞時(shí)后果是非常嚴(yán)重的，會(huì)導(dǎo)致疾病化，因此膽固醇穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持人體健康來(lái)說(shuō)非常重要6。

0-1 細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成（EserJ.Zerenturk,etal.[J]progressinLipidResear此外，細(xì)胞還可以通過控制膽固醇流出的方式來(lái)調(diào)控。多重跨膜蛋白P-binding cassette transporter A1, ABCA1）促進(jìn)細(xì)胞中磷脂向脂質(zhì)缺白 A-I（ApolipoproteinA-I, ApoA-I）轉(zhuǎn)移，，通過膽固醇�；D(zhuǎn)移酶-I 顆粒轉(zhuǎn)化為血液中的高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HD 與肝細(xì)胞中的清道夫受體 B1（scavengerreceptor-B1,SR-B1）結(jié)合，膽固醇酯轉(zhuǎn)移至肝臟，從而轉(zhuǎn)化為膽汁鹽排出體外[10]。
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96

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1 吳宇迪;;雙重降膽固醇新藥療效尚未定[J];心血管病防治知識(shí);2008年05期

2 王鄭昊;陸國(guó)平;陳楨s

本文編號(hào)：2705605