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納米HA-PNS-LIP靶向CD44對(duì)兔BMSCs成骨分化的研究

發(fā)布時(shí)間:2020-06-09 08:44
【摘要】:目的:構(gòu)建透明質(zhì)酸修飾的三七總皂苷靶向脂質(zhì)體(HA-PNS-LIP)及三七總皂苷脂質(zhì)體(PNS-LIP)的納米載藥遞送體系,對(duì)其基本性質(zhì)進(jìn)行表征及穩(wěn)定性檢測(cè)。HA-PNS-LIP靶向兔BMSCs表面CD44受體,通過(guò)檢測(cè)其鈣結(jié)節(jié)形成能力、成骨相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1、ALP及OCN的表達(dá),初步探討靶向BMSCs遞送PNS對(duì)其成骨能力的影響。方法:1.構(gòu)建HA-PNS-LIP及PNS-LIP載藥納米粒子,HPLC法測(cè)定藥物濃度及包封率、載藥量,粒徑分析儀檢測(cè)粒徑、PDI及Zeta電位,透射電子顯微鏡檢測(cè)形態(tài),同時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè);2.體外分離、培養(yǎng)及鑒定兔BMSCs;3.設(shè)立空白對(duì)照組(無(wú)干預(yù)措施的BMSCs)、PNS組(100mg/L PNS培養(yǎng)液的BMSCs)、HA-PNS-LIP組和PNS-LIP組(3個(gè)濃度:5、10、20μg/ml培養(yǎng)液的BMSCs);倒置熒光顯微鏡觀察BMSCs對(duì)各濃度HA-PNS-LIP、PNS-LIP的攝取效率;4.CCK-8法檢測(cè)載藥納米粒子對(duì)BMSCs的細(xì)胞毒性影響;5.第21天茜素紅染色法檢測(cè)各組鈣結(jié)節(jié)形成情況;6.藥物作用后第3、6、12天,用Real-time qPCR檢測(cè)TGF-β1、ALP及OCN的mRNA表達(dá)變化;7.藥物作用后第3、6、12天,用Western blot檢測(cè)TGF-β1、ALP及OCN的蛋白表達(dá)變化。8.載藥納米粒子作用第12天,用免疫熒光檢測(cè)TGF-β1、ALP及OCN的蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.納米載藥顆粒藥物濃度為923μg/ml;包封率:HA-PNS-LIP:86.65±0.45%,PNS-LIP:85.20±0.90%;載藥量:HA-PNS-LIP:7.89±0.04%,PNS-LIP:7.75±0.08%;粒徑:HA-PNS-LIP為72.84±0.14nm,PNS-LIP為69.33±1.39nm;PDI:HA-PNS-LIP為0.221±0.015,PNS-LIP為0.237±0.011;Zeta電位:HA-PNS-LIP為-18.55±0.07mV,PNS-LIP為-14.70±0.14mV;透射電子顯微鏡:兩種載藥納米粒子為類(lèi)圓形雙層囊泡結(jié)構(gòu);穩(wěn)定性:隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng),脂質(zhì)體溶液中藥物含量明顯下降。2.細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果:10、20μg/ml HA-PNS-LIP組細(xì)胞攝取效率≥50%;3.細(xì)胞毒性結(jié)果:10μg/ml HA-PNS-LIP組、PNS-LLP組對(duì)BMSCs細(xì)胞毒性最小。4.茜素紅染色結(jié)果:10μg/ml HA-PNS-LLP組鈣結(jié)節(jié)形成較其他3組明顯增強(qiáng),P0.05。5.Real-time qPCR和Western blot結(jié)果:從mRNA及蛋白層次看:(1)TGF-β1的表達(dá)變化:10μg/ml HA-PNS-LLP組的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)都高于其他實(shí)驗(yàn)組,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;10μg/ml PNS-LLP組介于10μg/ml HA-PNS-LLP組與100mg/L PNS組之間;各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)量都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。(2)ALP的表達(dá)變化:各實(shí)驗(yàn)組在6天時(shí)出現(xiàn)顯著高表達(dá)P0.01,12天時(shí)持續(xù)高表達(dá)P0.05;10μg/ml HA-PNS-LLP組的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)都高于其他實(shí)驗(yàn)組,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;10μg/ml PNS-LLP組介于10μg/ml HA-PNS-LLP組與100mg/L PNS組之間。(3)OCN的表達(dá)變化:各實(shí)驗(yàn)組在12天時(shí)出現(xiàn)顯著高表達(dá)P0.01;10μg/ml HA-PNS-LLP組的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)都高于其他實(shí)驗(yàn)組,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05;10μg/ml PNS-LLP組介于10μg/ml HA-PNS-LLP組與100mg/L PNS組之間。6.免疫熒光結(jié)果顯示:在12天,10μg/ml HA-PNS-LLP組的TGF-β1、ALP及OCN的蛋白表達(dá)較10μg/ml HA-PNS-LLP組為強(qiáng)陽(yáng)性。結(jié)論:1.構(gòu)建的HA-PNS-LIP、PNS-LIP載藥納米粒子具有良好的表征,2周內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性;2.10μg/ml HA-PNS-LIP靶向兔BMSCs遞送PNS可明顯增強(qiáng)鈣結(jié)節(jié)形成能力,可明顯促TGF-β1、ALP及OCN mRNA及蛋白的表達(dá),促成骨分化。
【圖文】:

演示圖,截留分子量


NHS)溶解完全,37 °C 下反應(yīng) 24 h。然后邊攪拌邊醇胺(Dioleoyl Phosphoethanolamine,DOPE)(48 下反應(yīng)過(guò)夜,轉(zhuǎn)移至透析袋中(截留分子量 8000 14純化,收集溶液,冷凍干燥即得 HA-DOPE 產(chǎn)物。飾 PNS 脂質(zhì)體的制備N(xiāo)S、0.5mg 異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyan卵磷脂溶于適量無(wú)水乙醇和氯仿的混合溶劑中,60劑,然后加入預(yù)熱的 HA-DOPE(1mg)水溶液水化細(xì)胞破碎儀超聲 1min 后,即得脂質(zhì)體溶液。隨后將袋(截留分子量 8000-14000KDa),于純水中透析純膜過(guò)濾得到 1mg/ml 淡黃色載藥脂質(zhì)體溶液。

曲線,演示圖


液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatogr的藥物含量。的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 5mgPNS,采用甲醇溶解并稀釋至 50、100、20系列濃度,,甲醇溶液作為空白對(duì)照。Agilent 11:DiamonsilC18(2)5μ250×4.6mm,流動(dòng)相:乙腈in,柱溫:30 °C,檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm 下檢測(cè)。橫為 PNS 色譜峰面積,建立線性回歸曲線。質(zhì)體載藥含量測(cè)定藥脂質(zhì)體溶液,采用甲醇溶解定容至標(biāo)曲濃度
【學(xué)位授予單位】:廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類(lèi)號(hào)】:R965

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本文編號(hào):2704435

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