【摘要】：鈣激活氯離子通道是哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)的陰離子通道蛋白,在跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)、平滑肌收縮、受精、嗅覺傳導(dǎo)、神經(jīng)元興奮和心臟動作電位復(fù)極化等多方面具有重要的生理功能。TMEM16A是第一個被確認(rèn)的CaCC,其表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞、呼吸道和消化道上皮細(xì)胞、腸道間質(zhì)Cajal細(xì)胞(interstitial cells of cajal,ICC)、感覺神經(jīng)元和多種腫瘤細(xì)胞。選擇性調(diào)節(jié)劑是研究離子通道重要的藥理工具,目前已發(fā)現(xiàn)了一些CaCCs選擇性調(diào)節(jié)劑(包括抑制劑和激活劑),但是由于選擇性低、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定和體內(nèi)活性較差等原因,都不完全滿足CaCCs體內(nèi)功能研究的需要。本研究利用功能熒光測定細(xì)胞模型(FRT-TMEM16A-YFP-H148Q/I152L)從天然小分子中篩選對TMEM16A氯離子通道具有抑制活性的化合物,利用熒光淬滅實驗和短路電流實驗分析活性化合物的基本分子藥理學(xué)性質(zhì),利用小鼠結(jié)腸離體組織短路電流實驗、小鼠腸道平滑肌收縮實驗、小鼠胃腸蠕動實驗以及大鼠血管環(huán)張力測定實驗對化合物進(jìn)行體內(nèi)外活性分析。實驗結(jié)果:1.利用FRT/TMEM16A/YFP-H148Q/I152L測定模型篩選得到四種黃酮類TMEM16A氯離子通道抑制劑,分別為杜鵑素、異鼠李素、石吊蘭素、黃芩素,IC_(50)值約為98.83μM、40.87μM、49.63μM、44.8μM。2.在FRT-TMEM16A-YFP-H148Q/I152L上進(jìn)行的短路電流測定結(jié)果顯示杜鵑素、異鼠李素、石吊蘭素、黃芩素均能以劑量依賴的方式抑制TMEM16A介導(dǎo)的氯離子電流,最大抑制效率分別為90%、73.9%、76.2%和91.3%,IC_(50)值分別約為49.7μM、20.83μM、24.5μM、27.3μM和20.1μM。3.在FRT-CFTR-YFP-H148Q/I152L上進(jìn)行熒光淬滅測定顯示杜鵑素、異鼠李素、石吊蘭素、黃芩素對CFTR介導(dǎo)的Cl~-電流具有激活作用,EC_(50)值分別為95.06μM、13.24μM、87.36μM、50.47μM。短路電流測定分析顯示低濃度(2~50μM)時杜鵑素和黃芩素對CFTR介導(dǎo)的Cl~-電流的激活作用,而高濃度(100~200μM)時杜鵑素和黃芩素對CFTR介導(dǎo)的Cl~-電流具有抑制作用,異鼠李素和石吊蘭素對CFTR介導(dǎo)的氯離子電流具有抑制作用。在T84細(xì)胞上,杜鵑素和石吊蘭素與在FRT-CFTR細(xì)胞上結(jié)果相同。低濃度(2~50μM)時杜鵑素對CFTR介導(dǎo)的Cl~-電流的激活作用,而高濃度(100~200μM)時杜鵑素對CFTR介導(dǎo)的Cl~-電流具有抑制作用,石吊蘭素對CFTR介導(dǎo)的氯離子電流具有激活作用,異鼠李素(50~200μM)對CFTR介導(dǎo)的Cl~-電流具有抑制作用。小鼠結(jié)腸粘膜短路電流結(jié)果顯示杜鵑素、異鼠李素、石吊蘭素、黃芩素對小鼠結(jié)腸粘膜上皮CFTR介導(dǎo)的氯離子電流沒有作用。4.在HT-29細(xì)胞上進(jìn)行熒光測定顯示異鼠李素和高濃度的杜鵑素對CaCC介導(dǎo)的Cl~-電流具有抑制作用,IC_(50)值分別為29.57μM、58.67μM。石吊蘭素和黃芩素對CaCC介導(dǎo)的Cl~-電流具有激活作用,EC_(50)值分別為40.57μM、50.16μM。在HT-29和T84細(xì)胞上進(jìn)行的短路電流實驗分析顯示杜鵑素在低濃度(2~20μM)時對CaCCs氯離子通道表現(xiàn)為激活作用,而高濃度(50~200μM)表現(xiàn)為抑制作用;異鼠李素在10~200μM濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為抑制作用,石吊蘭素和黃芩素在5~200μM濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)為激活作用。5.選擇性分析結(jié)果顯示上述四種黃酮類化合物在10~200μM范圍內(nèi)對小鼠結(jié)腸漿膜側(cè)Na~+-K~+-ATPase沒有抑制作用,但是對K~+通道有顯著抑制作用,抑制率分別為61.2%、54.3%、57.6%、82.1%。6.小鼠結(jié)腸粘膜短路電流結(jié)果顯示,100μM和200μM的杜鵑素能夠抑制小鼠結(jié)腸粘膜上皮由卡巴膽堿(CCh)激起的氯離子電流,分別抑制了8.7%和24.8%的電流,100μM和200μM的異鼠李素分別抑制了32.2%和48.9%的電流,100μM和200μM的石吊蘭素抑制了非常小的電流,100μM和200μM的黃芩素分別抑制了6%和21.7%的電流。7.小鼠全腸轉(zhuǎn)運(yùn)時間實驗結(jié)果顯示上述黃酮類化合物均能延長小鼠全腸轉(zhuǎn)運(yùn)時間,與對照組相比分別延長70%、65.6%、56.4%、64.5%。8.小鼠腸道平滑肌收縮實驗結(jié)果顯示100μM杜鵑素、異鼠李素、石吊蘭素、黃芩素均顯著降低了平滑肌收縮頻率,抑制收縮強(qiáng)度。9.大鼠血管環(huán)實驗結(jié)果顯示異鼠李素(50~300μM)能抑制由去甲腎上腺素(PE)引起血管平滑肌收縮增強(qiáng)。10.腫瘤細(xì)胞活力、遷移實驗結(jié)果顯示杜鵑素(1.5625~200μM)在SW620、NCM460細(xì)胞上均能抑制細(xì)胞活力。杜鵑素(200μM)對NCM460抑制效果最好,在50μM時對SW620抑制效果最好。異鼠李素(12.5μM)對NCM460抑制效果最好,在3.125μM時對SW620抑制效果最好。杜鵑素、異鼠李素均能抑制SW620細(xì)胞遷移。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了杜鵑素、異鼠李素、石吊蘭素、黃芩素四種黃酮類化合物能夠顯著抑制TMEM16A氯離子通道活性,對于進(jìn)一步揭示黃酮類化合物生理藥理學(xué)活性奠定了基礎(chǔ),為哮喘、肺動脈高血壓、腫瘤、慢傳輸型便秘等相關(guān)疾病的藥物治療提供新的策略和先導(dǎo)化合物。
【圖文】：

TMEM16A結(jié)構(gòu)

TMEM16A 在 ICC 中高表達(dá)，參與腸動力調(diào)控，，因此 TMEM16A 抑制劑可能通過減弱腸蠕動而治療腹瀉。圖1.2 腸道液體吸收與分泌機(jī)制Fig. 1.2 Intestinal fluid transporting mechanisms
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91;R96

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本文編號：2703145