【摘要】：乳腺癌是目前女性發(fā)病率最高的癌癥。傳統(tǒng)的手術治療、放療和化療易給患者帶來心理和身體上的傷害,以自由基為基礎的光動力療法和聲動力療法也因為腫瘤的乏氧環(huán)境、使用物理刺激的必要性等缺點被限制于臨床的應用。因此,如何構建出一種不需要氧氣和物理刺激、高效低毒的治療方式,對于提高乳腺癌的治療效果至關重要。在眾多的自由基中,除了單線態(tài)氧、羥基自由基和超氧自由基外,烷基自由基也具有較高的抗腫瘤活性,該自由基的形成不需要氧氣,僅通過熱刺激就可以有效生成,而線粒體自身的高溫特性為烷基自由基在腫瘤治療中的應用提供了一種新思路�；诖�,本課題構建了一種線粒體溫度激活的自由基爆發(fā)式逐級靶向納米粒(AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA),該給藥系統(tǒng)主要具有以下優(yōu)勢:(1)2,2’-氮雜雙(2-咪唑啉)二鹽酸鹽(2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride,AIPH)在熱刺激下可快速分解產生具有細胞毒性的烷基自由基,該分解過程不依賴于氧氣;(2)利用細胞器自身的特性觸發(fā)烷基自由基的生成,克服了以自由基為基礎的物理刺激響應性治療策略的局限性;(3)將兩種作用機制不同的藥物聯合用于腫瘤的治療:多烯紫杉醇(Docetaxel,DTX)通過誘導Bcl-2抗凋亡蛋白表達下調,促進AIPH所引發(fā)的線粒體凋亡通路;(4)逐級靶向納米粒具有葉酸(Folic acid,FA)和三苯基膦(Triphenylphosphine,TPP)兩種靶向基團,有助于實現DTX和AIPH的精準靶向釋放,在最大程度上發(fā)揮兩者的抗腫瘤作用,有利于減小藥物的副作用。具體研究內容如下:1.AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的制備與表征首先,通過檢測烷基自由基的產生,探究AIPH在不同溫度、不同pH以及不同生理條件下的分解情況。然后,采用溶膠-凝膠法制備介孔二氧化硅納米粒(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs)并進行線粒體靶向修飾(MSN-TPP),將AIPH裝載于MSN-TPP納米粒內(AIPH/MSN-TPP)。最后,通過薄膜分散法制備裝載DTX的葉酸靶向的pH敏感脂質薄膜,在脂質體水合過程中加入AIPH/MSN-TPP,通過自組裝形成AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA。實驗中我們發(fā)現AIPH同時具有溫度敏感性和酸敏感性,且AIPH的分解過程具有時間依賴性。氮氣吸附-脫附測定、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR)和透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)等實驗結果表明了納米粒合成過程中各階段產物的成功制備。粒徑分布和Zeta電位結果表明,所制備的AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的平均粒徑為87.8±3.1 nm,Zeta電位為-19.3±1.7 mV。體外釋放實驗表明,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA納米粒具有pH敏感釋藥特性,可防止DTX和AIPH在到達腫瘤部位前發(fā)生泄漏。2.AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的體外抗腫瘤活性研究以人乳腺癌MCF-7細胞為模型,對AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的體外抗腫瘤活性進行評價。細胞攝取分析結果顯示,逐級靶向給藥系統(tǒng)對MCF-7細胞具有良好的靶向能力。細胞毒性實驗表明,制備的載體系統(tǒng)安全性較好,AIPH和DTX具有協(xié)同抗腫瘤作用,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA能有效抑制MCF-7細胞的生長。溶酶體的熒光成像和線粒體共定位成像結果顯示,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA納米粒能夠實現溶酶體逃逸并且在線粒體內有效聚集。細胞內烷基自由基的檢測、線粒體膜電位的檢測、細胞色素C的釋放和單細胞凝膠電泳實驗結果表明,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA能夠在MCF-7細胞內產生烷基自由基并損傷線粒體,引起線粒體膜電位下降,導致細胞色素C等物質被釋放到細胞質中,對DNA造成損傷。細胞周期和細胞凋亡實驗結果顯示,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA能夠將細胞周期阻滯于S期和G2/M期,主要通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。Western blotting實驗結果驗證了DTX和AIPH的聯合抗腫瘤作用機制。以上結果表明,AIPH和DTX具有協(xié)同抗腫瘤作用,制備的AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA給藥系統(tǒng)可有效激活線粒體凋亡途徑并抑制MCF-7細胞的生長。3.AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的體內抗腫瘤活性研究以MCF-7細胞荷瘤裸鼠為動物模型,通過觀察逐級靶向給藥系統(tǒng)在裸鼠體內的分布情況、各給藥組裸鼠的相對腫瘤體積變化、相對體重的變化、組織切片的HE染色和TUNEL凋亡染色評價AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA給藥系統(tǒng)的藥效學和病理學特性。體內分布結果顯示,所制備的載藥系統(tǒng)能夠快速、持久地聚集在腫瘤部位。藥效學、病理學分析結果顯示,逐級靶向給藥系統(tǒng)的生物安全性較好,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA通過誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡/壞死進而抑制小鼠腫瘤的生長。以上結果表明AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA給藥系統(tǒng)對小鼠腫瘤具有較好的靶向能力和抑制作用。
【圖文】：

5圖 1.1 AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA 的制備及作用機制示意圖Figure 1.1 The preparation and schematic illustration ofAIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA

15圖 2.1 常氧和乏氧條件下 ABTS+ 的生成 2.1 Generation ofABTS+ in normoxic and hypoxic environm度條件下烷基自由基的生成敏物質，溫度越高，，其分解產生烷基自由基的速度越25 ℃、38 ℃、42 ℃、46 ℃和 50 ℃條件下的分解IPH 分解產生烷基自由基具有時間依賴性，在同一時產生的量最多，25 ℃最少，這一結果驗證了 AIPH AIPH 的分解。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943

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6 劉瀚e

本文編號：2702805