【摘要】：乳腺癌是目前女性發(fā)病率最高的癌癥。傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療和化療易給患者帶來心理和身體上的傷害,以自由基為基礎(chǔ)的光動(dòng)力療法和聲動(dòng)力療法也因?yàn)槟[瘤的乏氧環(huán)境、使用物理刺激的必要性等缺點(diǎn)被限制于臨床的應(yīng)用。因此,如何構(gòu)建出一種不需要氧氣和物理刺激、高效低毒的治療方式,對于提高乳腺癌的治療效果至關(guān)重要。在眾多的自由基中,除了單線態(tài)氧、羥基自由基和超氧自由基外,烷基自由基也具有較高的抗腫瘤活性,該自由基的形成不需要氧氣,僅通過熱刺激就可以有效生成,而線粒體自身的高溫特性為烷基自由基在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了一種新思路。基于此,本課題構(gòu)建了一種線粒體溫度激活的自由基爆發(fā)式逐級靶向納米粒(AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA),該給藥系統(tǒng)主要具有以下優(yōu)勢:(1)2,2’-氮雜雙(2-咪唑啉)二鹽酸鹽(2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride,AIPH)在熱刺激下可快速分解產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的烷基自由基,該分解過程不依賴于氧氣;(2)利用細(xì)胞器自身的特性觸發(fā)烷基自由基的生成,克服了以自由基為基礎(chǔ)的物理刺激響應(yīng)性治療策略的局限性;(3)將兩種作用機(jī)制不同的藥物聯(lián)合用于腫瘤的治療:多烯紫杉醇(Docetaxel,DTX)通過誘導(dǎo)Bcl-2抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào),促進(jìn)AIPH所引發(fā)的線粒體凋亡通路;(4)逐級靶向納米粒具有葉酸(Folic acid,FA)和三苯基膦(Triphenylphosphine,TPP)兩種靶向基團(tuán),有助于實(shí)現(xiàn)DTX和AIPH的精準(zhǔn)靶向釋放,在最大程度上發(fā)揮兩者的抗腫瘤作用,有利于減小藥物的副作用。具體研究內(nèi)容如下:1.AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的制備與表征首先,通過檢測烷基自由基的產(chǎn)生,探究AIPH在不同溫度、不同pH以及不同生理?xiàng)l件下的分解情況。然后,采用溶膠-凝膠法制備介孔二氧化硅納米粒(Mesoporous silica nanoparticles,MSNs)并進(jìn)行線粒體靶向修飾(MSN-TPP),將AIPH裝載于MSN-TPP納米粒內(nèi)(AIPH/MSN-TPP)。最后,通過薄膜分散法制備裝載DTX的葉酸靶向的pH敏感脂質(zhì)薄膜,在脂質(zhì)體水合過程中加入AIPH/MSN-TPP,通過自組裝形成AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)AIPH同時(shí)具有溫度敏感性和酸敏感性,且AIPH的分解過程具有時(shí)間依賴性。氮?dú)馕?脫附測定、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR)和透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了納米粒合成過程中各階段產(chǎn)物的成功制備。粒徑分布和Zeta電位結(jié)果表明,所制備的AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的平均粒徑為87.8±3.1 nm,Zeta電位為-19.3±1.7 mV。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA納米粒具有pH敏感釋藥特性,可防止DTX和AIPH在到達(dá)腫瘤部位前發(fā)生泄漏。2.AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的體外抗腫瘤活性研究以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為模型,對AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的體外抗腫瘤活性進(jìn)行評價(jià)。細(xì)胞攝取分析結(jié)果顯示,逐級靶向給藥系統(tǒng)對MCF-7細(xì)胞具有良好的靶向能力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,制備的載體系統(tǒng)安全性較好,AIPH和DTX具有協(xié)同抗腫瘤作用,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA能有效抑制MCF-7細(xì)胞的生長。溶酶體的熒光成像和線粒體共定位成像結(jié)果顯示,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA納米粒能夠?qū)崿F(xiàn)溶酶體逃逸并且在線粒體內(nèi)有效聚集。細(xì)胞內(nèi)烷基自由基的檢測、線粒體膜電位的檢測、細(xì)胞色素C的釋放和單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA能夠在MCF-7細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生烷基自由基并損傷線粒體,引起線粒體膜電位下降,導(dǎo)致細(xì)胞色素C等物質(zhì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中,對DNA造成損傷。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯于S期和G2/M期,主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了DTX和AIPH的聯(lián)合抗腫瘤作用機(jī)制。以上結(jié)果表明,AIPH和DTX具有協(xié)同抗腫瘤作用,制備的AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA給藥系統(tǒng)可有效激活線粒體凋亡途徑并抑制MCF-7細(xì)胞的生長。3.AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA的體內(nèi)抗腫瘤活性研究以MCF-7細(xì)胞荷瘤裸鼠為動(dòng)物模型,通過觀察逐級靶向給藥系統(tǒng)在裸鼠體內(nèi)的分布情況、各給藥組裸鼠的相對腫瘤體積變化、相對體重的變化、組織切片的HE染色和TUNEL凋亡染色評價(jià)AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA給藥系統(tǒng)的藥效學(xué)和病理學(xué)特性。體內(nèi)分布結(jié)果顯示,所制備的載藥系統(tǒng)能夠快速、持久地聚集在腫瘤部位。藥效學(xué)、病理學(xué)分析結(jié)果顯示,逐級靶向給藥系統(tǒng)的生物安全性較好,AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡/壞死進(jìn)而抑制小鼠腫瘤的生長。以上結(jié)果表明AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA給藥系統(tǒng)對小鼠腫瘤具有較好的靶向能力和抑制作用。
【圖文】：

5圖 1.1 AIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA 的制備及作用機(jī)制示意圖Figure 1.1 The preparation and schematic illustration ofAIPH/MSN-TPP@Lipo/DTX-FA

15圖 2.1 常氧和乏氧條件下 ABTS+ 的生成 2.1 Generation ofABTS+ in normoxic and hypoxic environm度條件下烷基自由基的生成敏物質(zhì)，溫度越高，，其分解產(chǎn)生烷基自由基的速度越25 ℃、38 ℃、42 ℃、46 ℃和 50 ℃條件下的分解IPH 分解產(chǎn)生烷基自由基具有時(shí)間依賴性，在同一時(shí)產(chǎn)生的量最多，25 ℃最少，這一結(jié)果驗(yàn)證了 AIPH AIPH 的分解。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943

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6 劉瀚e

本文編號：2702805