【摘要】：一、研究背景心腦血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)已經(jīng)嚴重威脅到人類健康,被認作人類健康的第一殺手。而動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管的疾病的首要病因。目前臨床上主要使用他汀類降血脂藥物治療AS,阿司匹林也作為抗炎、抑制血小板活化的抗AS藥物被應用于AS的一級和二級預防。他汀類降血脂藥物和阿司匹林在臨床上均發(fā)揮了一定療效,但是不能完全抑制AS的病程,且長期給藥的毒副作用也不斷涌現(xiàn)。因此尋找新型有效的抗AS藥物,建立毒副作用低的長期給藥系統(tǒng)對于防治AS進而防治CVD具有重大意義。動脈粥樣硬化是由多種因素誘發(fā)的慢性炎癥疾病。其中血管內(nèi)膜中的氧化應激誘導的炎癥反應是動脈粥樣硬化啟動的關(guān)鍵。細胞內(nèi)膜出現(xiàn)氧化應激后,活性氧及其氧化修飾的脂蛋白通過損傷內(nèi)皮細胞、刺激內(nèi)皮細胞分泌大量炎癥因子和趨化因子來激活血管內(nèi)膜中的炎癥反應。在AS的發(fā)展過程中氧化應激也有著至關(guān)重要的作用,例如通過一氧化氮損傷內(nèi)皮細胞功能,通過ROS促進血管內(nèi)膜分泌炎癥因子等都會促進AS病程的發(fā)展。所以有效抑制血管內(nèi)膜中的氧化應激是防治動脈粥樣硬化的重要策略。ARA290是由促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)衍生而來的具有11個氨基酸的組織保護性多肽。其已經(jīng)被證明具有良好的抗炎、抗氧化和促進組織修復的作用,是一個有潛力的抗AS藥物。我們將ARA290與具有活性氧(ROS)響應性的ox-bCD載體材料相結(jié)合,以納米沉淀-自主裝法合成了具有ROS響應性的納米粒遞送系統(tǒng),并觀察其體內(nèi)外的抗AS療效。二、研究方法1.ARA290治療動脈粥樣硬化的體外研究1.1ARA290對炎癥條件下巨噬細胞活性氧產(chǎn)生的影響PMA誘導RAW264.7 2 h后,加入不同劑量的ARA290共孵育2 h,用ROS熒光探針(DCFH-DA)行細胞內(nèi)ROS染色,流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)的活性氧水平,并熒光成像。1.2ARA290對炎癥條件下巨噬細胞分泌炎癥因子的影響小鼠巨噬細胞用LPS/IFN-γ刺激,加不同劑量的ARA290孵育12或24 h,產(chǎn)生的炎癥細胞因子MCP-1、TNF-α、IL-6用ELISA試劑盒檢測。1.3 ARA290對氧化誘導巨噬細胞凋亡的影響不同劑量的ARA290與RAW264.7共孵育2 h,加入H_2O_2孵育7 h,胰酶消化收集細胞,熒光探針染色,流式細胞術(shù)檢測ARA290對H_2O_2誘導巨噬細胞凋亡的保護作用,以及細胞內(nèi)的NO水平。1.4 ARA290對MCP-1誘導的巨噬細胞遷移的影響用Transwell法檢測不同濃度的ARA290對RAW264.7在MCP-1誘導下的遷移能力的影響。1.5 ARA290對巨噬細胞形成泡沫細胞的影響RAW264.7與(500 ng/mL)LPS共孵育4 h,加入不同劑量的ARA290和50μg/mLox-LDL孵育36 h,4%多聚甲醛固定,油紅染色拍照。1.6高劑量ARA290對小鼠巨噬細胞的安全性評價不同劑量的ARA290與RAW264.7共孵育24 h后,用CCK-8試劑盒檢測細胞存活率。2.ARA290的體內(nèi)抗AS性能評價9周齡ApoE~(-/-)小鼠高脂飲食4周,分3組,control組、ARA290高劑量組、ARA290低劑量組,每天腹腔給藥,共10周,最后一次給藥一天后處死,摘眼球取血測血常規(guī)和血生化指標,主動脈油紅染色后測斑塊面積。3.ARA290納米遞送系統(tǒng)的構(gòu)建3.1材料的合成與表征對羥甲基本硼酸頻那醇酯(PBAP)用N,N'-羰基二咪唑(CDI)活化以后,與β-CD、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶于無水DMSO中,25℃攪拌24 h,去離子水沉淀,水洗3次凍干后得到白色粉末狀產(chǎn)物,用傅里葉紅外光譜儀和核磁共振儀檢測其化學結(jié)構(gòu)3.2 ARA290活性氧響應性納米粒的制備通過納米沉淀法制備ARA290載藥納米粒,卵凝脂無水乙醇溶液與磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)去離子水溶液、去離子水65℃攪拌1 h充分混合形成水相。ARA290或FITC-ARA290溶于不同的有機溶液中,再與溶解有ox-bCD的甲醇溶液混溶形成油相。在0℃條件下將油相滴入水相,攪拌2 h,高速離心,去離子水洗3次后凍干,得到ARA290/ox-bCD、FITC-ARA290/ox-bCD納米粒。納米粒用去離子水重分散,馬爾文動態(tài)光散射粒徑儀測粒徑,用甲醇溶解,熒光分光光度法測載藥量和包封率。在銅網(wǎng)和云母片上滴上納米粒去離子水混懸液,分別用于透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)拍照。3.3 ARA290載藥納米粒的體外水解與釋放研究稱取適量FITC-ARA290/ox-bCD納米�；鞈矣诓煌琀_2O_2濃度的PBS溶液中,放置于37℃孵箱中,定時高速離心后取出部分上清,重分散后加入等量新鮮溶液,再放置于37℃孵箱中,取出的上清避光保存,用熒光分光光度計測定藥物的釋放量,并繪制藥物累計釋放曲線。4.ARA290載藥納米粒的體內(nèi)抗AS性能評價4.1ARA290載藥納米粒體內(nèi)抗AS性能評價9周齡ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)4周,分4組,model組、ARA290組、空白NPs組、載藥納米粒ARA290NPs組,腹腔給藥10周,最后一次給藥一天后處死,摘眼球取血測血常規(guī)和血生化指標,主動脈油紅染色后測斑塊面積。4.2ARA290載藥納米粒的初步安全性評價取8周齡balb/c小鼠,分別尾靜脈注射不同濃度的ARA290/NPs和0.1 mL PBS無菌溶液。正常喂養(yǎng)1周后,摘眼球取血,處死,測血生化和血常規(guī)以及臟器指數(shù)。三、研究結(jié)果1.ARA290能有效抑制小鼠巨噬細胞的炎癥反應和活性氧的產(chǎn)生通過流式和ELISA試劑盒檢測發(fā)現(xiàn),ARA290能夠有效抑制RAW264.7分泌炎癥相關(guān)細胞因子,如白細胞介素-1β(IL-6)、單核巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α),以及抑制炎癥巨噬細胞中ROS的產(chǎn)生。2.ARA290能夠抑制炎癥條件下小鼠巨噬細胞凋亡通過細胞流式檢測發(fā)現(xiàn),ARA290可以有效抑制炎癥條件下小鼠巨噬細胞的凋亡。3.ARA290能有效抑制小鼠巨噬細胞的遷移和泡沫細胞的形成通過細胞染色拍照發(fā)現(xiàn),ARA290能有效抑制由單核巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)誘導的巨噬細胞的遷移,以及對ox-LDL的攝取,抑制巨噬細胞來源泡沫細胞的形成。4.ARA290能有效抑制小鼠主動脈中的斑塊面積在ApoE~(-/-)小鼠模型的長期給藥中,低劑量的ARA290能有效抑制斑塊的增長,且沒有明顯的毒副作用。5.ARA290在小鼠巨噬細胞中,具有很高的安全性即使極高劑量的ARA290(1000μg/mL)與RAW264.7共孵育24 h,也不會誘導RAW264.7產(chǎn)生明顯的凋亡。6.成功合成了載體材料并對其結(jié)構(gòu)進行了表征以β-CD為原料,合成PBAP修飾的ox-bCD通過紅外和核磁共振檢測發(fā)現(xiàn),一個β-CD上結(jié)合了5個PBAP單元。7.成功構(gòu)建ARA290的活性氧響應性納米遞送系統(tǒng)并對其進行了表征ox-bCD不溶于水易溶于甲醇,ARA290易溶于水和酸性有機溶劑,不斷更改ARA290的溶劑,使其能與ox-bCD的甲醇溶液混溶形成油相,逐滴滴入水相,以納米沉淀-自組裝法合成了載藥量較高的ARA290/ox-bCD/NPs。8.ARA290活性氧響應性納米粒能夠減輕主動脈斑塊的面積在ApoE~(-/-)小鼠的長期給藥模型中,與ARA290組和空白納米粒組相比,ARA290/NPs組擁有最好的療效,能夠有效降低主動脈中的斑塊面積四、研究結(jié)論1.體內(nèi)外實驗均表明ARA290具有抗動脈粥樣硬化的作用。2.成功構(gòu)建了基于ox-bCD的ARA290納米遞送系統(tǒng)。3.體內(nèi)實驗表明ARA290活性氧響應性納米粒具有抗動脈粥樣硬化作用,且有效提高了ARA290的藥效。
【圖文】：

A 圖 7.巨噬細胞內(nèi) ROS 水平。A：免疫熒光圖（標0.05, ***P2.1.3 討 論在 RAW264.7 細胞中，ARA290 抑制具有一定的劑量依賴性。1 μg/mL 和 10 μg生，且給藥 12 h 和 24 h 之間沒有顯著性差癥因子 TNF-α、IL-6、MCP-1 的產(chǎn)生，且劑藥 12 h 和 24 h 之間差異顯著，其余沒有還是在 THP-1 細胞中，中高劑量的 ARA29化因子。在 PMA 的誘導下，巨噬細胞內(nèi)能產(chǎn)生

除 Control 外每孔加入 200 μM H2O2，37℃、5%CO2條件下細胞養(yǎng) 12 h。收集培養(yǎng)基于 4 mL 離心管中，預冷的 PBS 小心沖洗孔板內(nèi)細胞一有 EDTA 的胰酶消化，完全培養(yǎng)基終止反應，收集于原來的 4 mL 離心管中離心 5 min，棄去上清。2) 0.5 mL Staining Buffer 重懸細胞，轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 的離心管中，1000 rpm 棄去上清。加入 100 μLAnnexin V Binding Buffer 重懸細胞。3) 加入 5 μL FITC 溶液，10 μL PI 溶液，，輕微震蕩，常溫下避光孵育 15 min4) 加入 200 μLAnnexin V binding buffer，震蕩均勻，AccuriC6 流式細胞儀檢2 實驗結(jié)果如圖8-9所示，RAW264.7在受到H2O2損傷后，出現(xiàn)大量凋亡，極低劑量的 ARng/mL）不能抑制 RAW264.7 細胞凋亡，低劑量和高劑量的 ARA290 能有效凋亡，且兩者之間沒有顯著差異。
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96

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