【摘要】：目的:(1)EGCG衍生物Y6體內(nèi)對(duì)人肝癌血管生成的影響及機(jī)制研究。(2)EGCG衍生物Y6體內(nèi)增效減毒柔紅霉素抗肝癌作用及機(jī)制研究。方法:建立人HepG2裸鼠移植瘤模型,隨機(jī)分為8個(gè)組(n=8,雌雄各半),分別為對(duì)照組(0.5%羧甲基纖維素鈉)、EGCG(40mg/kg)組、Y6-M(55 mg/kg)組、DNR(2mg/kg)組、DNR(2mg/kg)+Y6-H(110mg/kg)組、DNR(2mg/kg)+Y6-M(55mg/kg)組、DNR(2mg/kg)+Y6-L(27.5 mg/kg)組和DNR+EGCG組,EGCG和Y6每天灌胃給藥,DNR每四天腹腔注射給藥,20d后處死裸鼠,取瘤稱重。第一部分實(shí)驗(yàn)方法:用內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)算瘤組織血管密度(MVD);RT-PCR檢測(cè)瘤組織中VEGF mRNA的表達(dá);免疫組織化學(xué)法和Western blotting檢測(cè)瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)。第二部分實(shí)驗(yàn)方法:⑴稱瘤重,計(jì)算抑瘤率,HE染色觀察瘤組織形態(tài)結(jié)的構(gòu)變化,TUNEL染色計(jì)算瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù);⑵HE染色觀察心肌形態(tài)結(jié)的構(gòu)變化,測(cè)定心肌中SOD活力及MDA的含量;⑶RT-PCR檢測(cè)瘤組織中CBR1 mRNA的表達(dá),免疫組織化學(xué)法和Western blotting檢測(cè)瘤組織CBR1蛋白的表達(dá),高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)血清中柔紅霉素的代謝產(chǎn)物柔紅霉素醇的濃度。第三部分實(shí)驗(yàn)法:RT-PCR檢測(cè)瘤組織中HIF-1αmRNA的表達(dá),免疫組織化學(xué)法檢測(cè)瘤組織中HIF-1α蛋白的表達(dá),Westernblotting檢測(cè)HIF-1α及MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ERK1/2/p-ERK1/2和AKT/p-AKT蛋白的表達(dá)。結(jié)果:第一部分EGCG衍生物Y6單用或聯(lián)合柔紅霉素對(duì)人肝癌血管生成的抑制作用(1)瘤組織血管密度:與對(duì)照組相比,EGCG、Y6和DNR單用均能顯著抑制瘤組織血管的生成(P0.05);與DNR組相比,各聯(lián)合給藥組的瘤組織的MVD顯著減少(P0.01);Y6-M單用或聯(lián)合DNR組瘤組織的MVD均顯著低于EGCG單用或聯(lián)合DNR(P0.05或P0.01)。Y6對(duì)移植瘤組織MVD的抑制作用呈劑量依賴性。(2)瘤組織VEGF mRNA的表達(dá):與對(duì)照組相比,EGCG、Y6-M和DNR單用均能顯著抑制瘤組織VEGF mRNA的表達(dá)(P0.05或P0.01);與DNR組相比,Y6或EGCG聯(lián)合DNR顯著減少VEGF mRNA的表達(dá);Y6-M單獨(dú)或聯(lián)合DNR分別與EGCG單獨(dú)或聯(lián)合DNR相比,瘤組織VEGF mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Y6對(duì)瘤組織VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用具有劑量依賴性。(3)瘤組織VEGF蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比,Y6-M組和DNR組瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.05或P0.01);與DNR組相比,EGCG或Y6聯(lián)合DNR顯著下調(diào)瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)(P0.05或P0.01);分別與EGCG單獨(dú)或聯(lián)合DNR相比,Y6-M單獨(dú)或聯(lián)合DNR瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)量顯著減少(P0.05或P0.01);Y6對(duì)瘤組織VEGF蛋白表達(dá)的抑制作用具有劑量依賴性。第二部分EGCG衍生物Y6體內(nèi)增效減毒蒽環(huán)類抗生素抗肝癌作用的研究1、Y6單用或聯(lián)合柔紅霉素對(duì)裸鼠肝癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用(1)抑瘤率:EGCG、Y6單用對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用并不是很強(qiáng),但均可增強(qiáng)DNR對(duì)移植瘤的抑制作用;經(jīng)金正均法計(jì)算,Y6-M聯(lián)合DNR的q1.15,兩者聯(lián)用具有協(xié)同作用;Y6-M或Y6-H聯(lián)合DNR的抑瘤率顯著大于EGCG聯(lián)合DNR,并呈劑量依賴性。(2)瘤組織病理檢查:瘤組織細(xì)胞異型明顯,核漿比例增加,核大深染。EGCG或Y6聯(lián)合DNR組瘤組織壞死程度均較單獨(dú)給藥組增加;隨著Y6劑量的增加瘤組織壞死面積增加。(3)TUNEL染色的結(jié)果:瘤組織凋亡細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色,核深染呈棕黃色。與對(duì)照組相比,EGCG組、Y6-M組及DNR組瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P0.05或P0.01);與DNR組相比,各聯(lián)合給藥組瘤組織凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加(P0.01);Y6單用或聯(lián)合DNR組促進(jìn)瘤組織細(xì)胞凋亡的作用均顯著強(qiáng)于EGCG單用或聯(lián)合DNR(P0.05或P0.01),并具有劑量依賴性。2、EGCG衍生物Y6對(duì)柔紅霉素所致裸鼠心肌毒性損傷的保護(hù)作用(1)心肌組織HE染色結(jié)果:與對(duì)照組對(duì)比,EGCG組和Y6-M組心肌細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞間隙正常無水腫,對(duì)裸鼠心肌基本無毒性作;DNR組裸鼠心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞輪廓模糊不清,細(xì)胞間隙變窄;EGCG與Y6對(duì)DNR所致裸鼠心肌組織損傷均有保護(hù)作用。(2)心肌SOD活力和MDA含量的檢測(cè):與對(duì)照組相比,DNR組心肌SOD活性顯著下降(P0.01),同時(shí)MDA含量顯著增加(P0.01);與DNR組相比,各聯(lián)合給藥組心肌組織均較DNR組SOD活力顯著增加(P0.01),MDA含量顯著減少(P0.01),Y6對(duì)DNR所致心臟毒性的保護(hù)作用強(qiáng)于EGCG,并呈劑量依賴性。3、EGCG衍生物Y6減少瘤組織CBR1的表達(dá)及柔紅霉素醇的生成(1)瘤組織CBR1 mRNA的表達(dá):與對(duì)照相比,EGCG組及Y6-M組瘤組織CBR1 mRNA的表達(dá)顯著降低(P0.05或P0.01);與DNR組相比,各聯(lián)合給藥組瘤組織CBR1 mRNA的表達(dá)顯著降低(P0.01);Y6對(duì)瘤組織CBR1 mRNA表達(dá)的抑制作用呈劑量依賴性。(2)瘤組織CBR1蛋白的表達(dá):與對(duì)照組相比,Y6-M組瘤組織CBR1蛋白的表達(dá)顯著降低(P0.05);與DNR組相比,EGCG或Y6聯(lián)合DNR組瘤組織CBR1蛋白的表達(dá)量顯著減少(P0.01)。(3)HPLC檢測(cè)柔紅霉素醇的濃度:EGCG和Y6均可減少柔紅霉素醇的生成,Y6對(duì)DNR代謝抑制作用比EGCG強(qiáng);隨著Y6劑量的增加血清中柔紅霉素醇濃度減少。第三部分Y6單用或聯(lián)合柔紅霉素通過MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)瘤組織中HIF-1α表達(dá)的影響。(1)瘤組織HIF-1α的表達(dá):Y6單用對(duì)瘤組織HIF-1α基因及蛋白表達(dá)的抑制作用顯著強(qiáng)于EGCG;EGCG或Y6-M聯(lián)合DNR對(duì)瘤組織HIF-1α基因表達(dá)的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),Y6-M聯(lián)合DNR對(duì)瘤組織HIF-1α蛋白的表達(dá)顯著強(qiáng)于EGCG聯(lián)合DNR(P0.01),Y6對(duì)HIF-1α基因及蛋白表達(dá)的抑制作用具有劑量依賴性。(2)ERK1/2/p-ERK1/2和AKT/p-AKT蛋白表達(dá):Y6或DNR單用均顯著抑制瘤組織p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表達(dá)(P0.05或P0.01),Y6的作用強(qiáng)于EGCG。EGCG或Y6均可增強(qiáng)DNR對(duì)瘤組織p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)的抑制作用;Y6對(duì)瘤組織p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)的抑制作用具有劑量依賴性。結(jié)論:1、EGCG衍生物Y6體內(nèi)抑制人肝癌移植瘤血管的生成。2、EGCG衍生物Y6體內(nèi)增效減毒蒽環(huán)類抗生素抗肝癌作用。3、EGCG衍生物Y6體內(nèi)抑制血管生成和增效減毒蒽環(huán)類抗生素抗肝癌作用可能與其抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)HIF-1α、CBR1及VEGF的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)棕褐色，可以觀察到血管內(nèi)皮細(xì)胞有呈褐色顆粒狀、形成管腔或閉合的條索狀分布，如圖 1-1 所示。各組裸鼠移植瘤組織的 MVD 統(tǒng)計(jì)如表 1-3、圖 1-2 所示，與對(duì)照組瘤組織相比，EGCG組、Y6-M 組及 DNR 組的 MVD 均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；說明 EGCG 或 Y6 單用對(duì)瘤組織微血管生成有抑制作用；與 DNR 組相比，，各聯(lián)合組的 MVD 顯著減少（P<0.01），并且 Y6 聯(lián)合 DNR 各組的 MVD隨著 Y6 劑量的增加而減少，說明 Y6 對(duì) DNR 抑制裸鼠移植瘤微血管生成具有增效作用并呈劑量依賴性。Y6-M 組的 MVD 為（37.27±2.07）顯著低于 EGCE 組（43.38±2.68），與 DNR+EGCG 組相比較，DNR+Y6-M 組 MVD顯著降低（P<0.05）。說明 Y6 單用或聯(lián)合 DNR 用藥對(duì)瘤組織微血管生成的抑制作用比 EGCG 強(qiáng)。

6 體內(nèi)抑制血管生成和增效減毒柔紅霉素抗肝癌作用及其機(jī)制研究 2018表 1-3 各組腫瘤組織的平均血管密度（x s，n=8）Tab1-3 Average vascular density of tumor tissues in each group (x s, n=組別 平均血管密度（個(gè)/視野）對(duì)照組 52.00±5.03EGCG 組 43.38±2.68△△Y6-M 組 37.27±2.07△△##DNR 組 31.47±2.29△△DNR+Y6-H 組 10.60±1.28**DNR+Y6-M 組 14.87±1.35**#DNR+Y6-L 組 24.73±1.53**DNR+EGCG 組 18.93±1.26**相比較，△P㩳0.05 或△△P㩳0.01；與 DNR 組相比較，*P㩳0.05 或**P㩳較，#P㩳0.05 或##P㩳0.01
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2701535