本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌群體感應抑制劑的分離與活性評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前,細菌耐藥問題日益嚴重,使傳統(tǒng)抗生素面臨著失效的危險,直接威脅到人類的生命健康。因此,尋找新的靶點來開發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。群體感應(Quorum sensing, Q S)是指細菌通過感知菌群中信號分子的濃度變化,從而對周圍環(huán)境做出自身調(diào)整以抵抗不利因素的行為。QS系統(tǒng)調(diào)控著致病菌的多種行為如生物被膜的形成及毒力因子的表達。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種常見的機會致病菌,它的耐藥性及毒力使得治療銅綠假單胞菌感染十分困難。P. aeruginosa的群體感應(QS)系統(tǒng)對其致病力及毒力的產(chǎn)生(如綠膿菌素、鼠李糖脂、彈性蛋白酶、swarming運動、生物被膜的形成等)具有重要調(diào)控作用。因此,干擾P. aeruginosa QS系統(tǒng)是削弱其毒力的一個發(fā)展策略。群體應抑制劑(Quorum sensing inhibitors, QSIs)能夠降低P. aeruginosa毒力及致病力,同時不抑制細菌的生長,與傳統(tǒng)抗生素相比不會對細菌的生存產(chǎn)生選擇性壓力,理論上不易產(chǎn)生細菌耐藥性,為新型抗感染藥物的研究提供了一條新的途徑。本實驗室在前期工作中發(fā)現(xiàn)海洋真菌Aspergillus sp. SY012的發(fā)酵產(chǎn)物及中藥厚樸的粗提物具有銅綠假單胞菌群體感應抑制活性。本文目的是從Aspergillus sp. SY012的發(fā)酵產(chǎn)物及厚樸的粗提物中追蹤分離群體感應抑制劑,并對其活性進行評價。利用P. aeruginosa (QSIS-lasI)及P. aeruginosa (PQSI-pqsA)報告菌株追蹤檢測Aspergillus sp. SY012發(fā)酵粗提物的活性,采用硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析、HPLC對活性成分進行分離純化,最終得到兩個活性化合物,利用核磁共振波譜解析確定化合物結(jié)構(gòu)分別為α-環(huán)匹阿尼酸及其同分異構(gòu)體異α-環(huán)匹阿尼酸。數(shù)據(jù)分析表明,在亞抑菌濃度下,它們對P. aeruginosa PAOI的彈性蛋白酶活性、綠膿菌素及鼠李糖脂產(chǎn)量、swarming運動等毒力因子都具有顯著抑制作用,并且可顯著降低las、rhl及pqs系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達。利用大腸桿菌異源報告菌株E. coli MG4/pKDT 17和E. coli pEAL08-2檢測異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對las和pqs群體感應系統(tǒng)的作用,異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對于異源表達的las及pqs系統(tǒng)均有顯著抑制作用,其中相同濃度的異α-環(huán)匹阿尼酸活性強于α-環(huán)匹阿尼酸。二者具有相同的平面結(jié)構(gòu),唯不同就是5位C的立體結(jié)構(gòu),可能對化合物的QSI活性起到重要作用。利用了P. aeruginosa (QSIS-lasI)報告菌株對中藥厚樸的粗提物進行活性追蹤及檢測,得到明顯的活性位點,采用生物自顯影薄層色譜、制備薄層色譜和高效液相色譜技術(shù)分離到活性化合物,通過核磁共振波譜解析確定活性化合物為和厚樸酚。在亞抑菌濃度下,和厚樸酚能夠抑制P. aeruginosa PAOI毒力因子的產(chǎn)生,包括swarming運動、綠膿菌素及鼠李糖脂產(chǎn)量,RT-PCR檢測結(jié)果表明和厚樸酚對P. aeruginosa PAOI QS相關(guān)調(diào)控基因的mRNA表達水平有顯著抑制作用。和厚樸酚(honokiol)是具有抗氧化,抗炎,抗焦慮,抗抑郁等多種生物活性的多酚,為厚樸的主要成分。和厚樸酚作為P. aeruginosa QSI,是它生物活性的又一新發(fā)現(xiàn)。本文從Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵產(chǎn)物及中藥厚樸的粗提物中分離得到了銅綠假單胞菌群體感應抑制劑,并首次發(fā)現(xiàn)α-環(huán)匹阿尼酸、異α-環(huán)匹阿尼酸及和厚樸酚具有QSI活性,為QSI的結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系研究提供良好的前體化合物。本研究具有明確的應用前景和一定的理論意義。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌群體感應抑制劑 Aspergillus sp.SY012 厚樸 α-環(huán)匹阿尼酸 異α-環(huán)匹阿尼酸 和厚樸酚
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R915
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 0 前言13-31
• 0.1.細菌耐藥現(xiàn)狀及研究背景13-14
• 0.2. 細菌群體感應系統(tǒng)14-26
• 0.2.1 革蘭氏陽性細菌群體感應系統(tǒng)15-16
• 0.2.2 AI-2細菌種間群體感應系統(tǒng)16-17
• 0.2.3 AI-3群體感應系統(tǒng)17-18
• 0.2.4 革蘭陰性菌群體感應系統(tǒng)18-26
• 0.2.4.1 銅綠假單胞菌群體感應系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制20-22
• 0.2.4.2 銅綠假單胞菌的致病機制及感染現(xiàn)狀22-23
• 0.2.4.3 銅綠假單胞菌致病機制及主要毒力因子23-26
• 0.3 群體感應抑制因子的研究進展26-29
• 0.3.1 針對QS信號分子合成過程的QSI26
• 0.3.2 針對信號分子結(jié)構(gòu)的QSI26-28
• 0.3.2.1 群體感應淬滅酶27-28
• 0.3.2.2 抗體28
• 0.3.3 針對信號分子受體的群體感應抑制劑28-29
• 0.3.4 以銅綠假單胞菌QS為靶標開發(fā)群體感應抑制劑29
• 0.4 本文的研究內(nèi)容及意義29-31
• 1. Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵產(chǎn)物中QSI的分離及活性檢測31-65
• 1.1 實驗材料及儀器31-32
• 1.1.1 實驗材料及試劑31
• 1.1.2 實驗儀器31-32
• 1.1.3. 模型菌株32
• 1.2 實驗方法32-39
• 1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置及滅菌32-33
• 1.2.2 Aspergillus sp.SY012的發(fā)酵培養(yǎng)33
• 1.2.3 Aspergillus sp.SY012發(fā)酵浸膏的制備33
• 1.2.4 檢測Aspergillus sp.SY012發(fā)酵產(chǎn)物的群體感應抑制活性33-34
• 1.2.5. Aspergillus sp.SY012發(fā)酵粗提物中群體感應抑制劑的分離純化34-35
• 1.2.6 活性化合物結(jié)構(gòu)鑒定35
• 1.2.7. 檢測活性化合物對銅綠假單胞菌PAOI生長的影響及對毒力因子作用35-37
• 1.2.8. 在大腸桿菌中檢測活性化合物對las及pqs系統(tǒng)的作用37-38
• 1.2.9. 實時熒光定量PCR檢測銅綠假單胞菌QS相關(guān)基因的mRNA表達水平38-39
• 1.3 實驗結(jié)果39-62
• 1.3.1 Aspergillus sp.SY012發(fā)酵浸膏的制備39
• 1.3.2 初步檢測Aspergillus sp.SY012發(fā)酵粗提物的群體感應抑制劑活性39-40
• 1.3.3 追蹤檢測Aspergillus sp.SY012發(fā)酵粗提物的群體感應抑制活性40
• 1.3.4 Aspergillus sp.SY012中群體感應抑制劑的活性追蹤分離40-53
• 1.3.4.1 G1組分的分離純化43-48
• 1.3.4.2 G2組分的分離純化48-53
• 1.3.5 12-1及12-2的結(jié)構(gòu)53-55
• 1.3.6 初步檢測α-環(huán)匹阿尼酸及異α-環(huán)匹阿尼酸的活性55
• 1.3.7 α-環(huán)匹阿尼酸及異α-環(huán)匹阿尼酸的QSI活性評價55-62
• 1.3.7.1 α -環(huán)匹阿尼酸及異α-環(huán)匹阿尼酸對P.aeruginosa PAOI生長影響55-56
• 1.3.7.2 α-環(huán)匹阿尼酸及異α-環(huán)匹阿尼酸對P.aeruginosa PAOI毒力因子的影響56-60
• 1.3.7.3 大腸桿菌異源檢測模型檢測異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對las和pqs系統(tǒng)的作用60-61
• 1.3.7.4 異α-環(huán)匹阿尼酸及α-環(huán)匹阿尼酸對P.aeruginosa PAOI群體感應相關(guān)基因表達的影響61-62
• 1.4 討論62-64
• 小結(jié)64-65
• 2 中藥厚樸中群體感應抑制劑的分離與活性評價65-72
• 2.1 實驗材料、試劑及儀器65
• 2.1.1 實驗材料及試劑65
• 2.1.2 實驗儀器65
• 2.2 實驗方法65-66
• 2.2.1. 中藥材處理方法及厚樸粗提物的制備65-66
• 2.2.2. 中藥粗提物QSI活性檢測66
• 2.2.3. 銅綠假單菌毒力因子檢測66
• 2.2.4 銅綠假單胞菌QS相關(guān)基因的mRNA檢測66
• 2.3 實驗結(jié)果66-70
• 2.3.1 厚樸中活性成分確定及活性評價66-70
• 2.3.1.1 厚樸中QSI的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定66-67
• 2.3.1.2 和厚樸酚的QSI活性評價67-70
• 2.4 討論70-71
• 小結(jié)71-72
• 3. 總結(jié)與展望72-73
• 3.1 總結(jié)72
• 3.2 展望72-73
• 參考文獻73-81
• 致謝81-82
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果82

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