【摘要】：糖蛋白藥物的糖修飾包括糖基化修飾和糖化修飾,對糖蛋白藥物的安全性、穩(wěn)定性、免疫原性及生物學(xué)活性等有重要影響,與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此糖蛋白藥物糖修飾研究具有重要意義。由于不同糖蛋白藥物的糖修飾復(fù)雜性不同,目前對糖修飾的全面研究仍是個巨大的挑戰(zhàn),為此針對不同糖蛋白藥物的糖修飾開發(fā)全面解析策略是十分必要的。本論文從完整蛋白、糖肽及糖鏈水平等多個角度對糖蛋白藥物糖基化修飾和糖化修飾及其對電荷異質(zhì)性的影響進行了研究。第一章,首先介紹了糖蛋白藥物的現(xiàn)狀、糖修飾分類及其重要性,其次對常用的糖基化修飾含量、位點及糖型研究方法和糖化修飾研究策略進行了概述。第二章,以BSA為標(biāo)準品建立“準內(nèi)標(biāo)法”,BSA多電荷峰RSD均≤0.075%,批間RSD為0.001%~0.004%,方法誤差均0.01%,說明該檢測方法準確性好,可靠性高,利用該方法實現(xiàn)了對rhTPO中N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖相對含量的準確測定,生物類似藥分別為24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,原研藥分別為25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,該方法不僅排除了標(biāo)準品的干擾還提高了測定準確度,在應(yīng)用于復(fù)雜糖蛋白的一致性分析方面有明顯優(yōu)勢;根據(jù)完整含糖分子量分析8種單抗的主要N-糖糖型均為G0F/G0F和G0F/G1F,己糖指數(shù)(HexI)在0.2~1.6之間,HexI越低,G0F/G0F相對比例越高,HexI越高,G0F/G0F相對比例降低而G0F/G1F、G1F/G1F和G1F/G2F相對增加,己糖指數(shù)能良好的反映抗體藥物的基礎(chǔ)糖型分布,可作為發(fā)酵工藝優(yōu)化和糖型質(zhì)量控制的重要參數(shù)。此外,我們提出了唾液酸指數(shù)(SAI)這一概念,并應(yīng)用于單抗唾液酸糖型分析和電荷異構(gòu)體分析,3批單抗SAI在0.016~0.019之間,批間一致性良好。上述完整蛋白層次分析糖蛋白糖修飾一致性的新概念和新方法對于糖蛋白藥物快速質(zhì)量評價具有重要參考價值。第三章,為分析復(fù)雜糖蛋白藥物的糖位點,本研究結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜從糖肽水平分析重組人促紅細胞生成素(rhEPO)和rhTPO N-糖和O-糖修飾位點。成功鑒定rhEPO三個N-糖位點(N24、N38、N83)和一個O-糖位點(S126),得分均大于700分,鑒定結(jié)果可靠,采用“檢出次數(shù)法”和“離子強度法”分析各位點糖基化率均證實N38最高,其次是N24,而N83最低,兩種方法得到的總糖基化修飾率均大于65%,方法間和批間一致性良好;成功鑒定rhTPO五個N-糖位點(N176,N185,N213,N234和N327),鑒定得分均大于300分,均非�？煽�,兩種方法分析各位點修飾率均證實N176和N185最高,其次是N234和N327,而N213最低,總糖基化修飾率均大于75%,方法間和批間一致性良好,此外,根據(jù)rhTPO的O-糖糖型得到57個O-糖位點,S106位點相對比例為49%,明顯高于其他位點,是rhTPO最主要的O-糖基化修飾位點。糖基化修飾率分析為復(fù)雜糖蛋白藥物的批間比對研究提供了一種簡單有效的方法。除此之外,本研究還通過O~(18)標(biāo)記成功鑒定地諾單抗N-糖糖位點N298,得分949分,鑒定結(jié)果非�？煽�,該方法有效的避免了堿性環(huán)境引起的自發(fā)脫氨基造成的假陽性,有利于后續(xù)復(fù)雜糖蛋白糖位點研究。第四章,在糖鏈和糖肽兩個層次解析單抗和復(fù)雜糖蛋白的糖型。首先在糖鏈水平根據(jù)GU值成功歸屬22個N-糖糖型,共有糖型相對比例大于98%,批間一致性良好,其中,G0F相對比例最高,其次是G1F。采用UPLC-MS/MS驗證了11個色譜峰,對應(yīng)11個抗體糖型。然后,采用優(yōu)化的糖型篩選方法在糖肽水平共檢出5種單抗的139種N-糖糖型,其中共有糖型30種,G0F在5種抗體中的相對比例均最高,為最主要糖型,與糖鏈水平分析結(jié)果一致。最后,在糖肽水平分析了復(fù)雜糖蛋白藥物rhTPO糖型,共鑒定N-糖糖型226種、O-糖糖型75種,其中,主要N-糖糖型共22種、O-糖糖型26種,批間一致性良好。本研究為單抗和復(fù)雜糖蛋白藥物糖型解析提供了較全面的研究策略。第五章,糖化(Glycation)是化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的蛋白質(zhì)糖修飾,與工藝密切相關(guān),一般應(yīng)避免,國外有少量報道而國內(nèi)未見報道。本研究建立了從抗體糖化樣本收集到超高分辨質(zhì)譜檢測的糖化分析策略。從完整分子和酶解肽段兩個層面分析,糖化樣本與常規(guī)樣本相比,己糖指數(shù)多1左右,糖化樣本以1~2個賴氨酸(K)己糖化修飾為主,輕鏈第100/150/170位K為輕鏈主要糖化位點,而重鏈還存在精氨酸(R)和N-端糖化,重鏈第325位K、N-端易發(fā)生糖化。本研究不僅可以在表征和評價單抗藥物的質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用,還有助于單抗藥物培養(yǎng)工藝、配方和制劑工藝的開發(fā),為單抗藥物藥效和功能研究提供新思路。第六章,利用陽離子交換色譜(CEX)收集IgG1和IgG2抗體的電荷異構(gòu)體(酸性組分,主成分,堿性組分),采用超高分辨質(zhì)譜從完整分子、酶切肽段兩個層次分析其電荷異質(zhì)性來源。對于IgG1,完整含糖分子共檢出12種糖型,其中7個糖型在3個組分中均檢出且相對比例一致,可排除基礎(chǔ)糖型影響,5個差異糖型均含唾液酸,根據(jù)SAI分析,糖鏈末端唾液酸個數(shù)越多,唾液酸指數(shù)越高,蛋白酸性越大,唾液酸是其電荷異質(zhì)性的主要來源之一。去N-糖抗體共檢出8個質(zhì)譜峰,N-端Q均發(fā)生焦谷氨酸化(PyroQ),因此N-端PyroQ不是電荷異質(zhì)性的來源,兩個酸性組分的糖化比例略大于主成分,但差異不大,糖化可能是電荷異質(zhì)性來源之一。從酶解肽段層面分析,顯示脫酰胺和糖化修飾在酸性組分中略高,可能是酸性組分的來源之一,但不是電荷異質(zhì)性重要來源之一,氧化和N-端焦谷氨酸化修飾基本無貢獻,輕重鏈主要修飾位點修飾率組分間有微弱差異,它們可能對電荷異質(zhì)性有微弱影響。對于IgG2,通過切糖前后等電點毛細管電泳比對,證實N-糖修飾不是導(dǎo)致其電荷異質(zhì)性的重要原因,采用超高分辨質(zhì)譜分析3個電荷異構(gòu)體,顯示IgG_2-A型二硫鍵相對比例在Peak3中最高,IgG_2-B型二硫鍵相對比例在Peak1~Peak3之間呈遞減趨勢,IgG_2-A/B型二硫鍵(A/B)相對比例在兩種統(tǒng)計方法中略有差別,說明二硫鍵是導(dǎo)致地諾單抗電荷異構(gòu)體形成的主要原因。本研究提供了一個較完整的電荷異構(gòu)體分析方法,為新藥篩選和質(zhì)量控制提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
【圖文】：

圖 1.MALDI-TOF 質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法(上)和準內(nèi)標(biāo)法(下)示意圖a,b:校正值;c:校正后值Fig 1.Schematic diagram of internal(top) and quasi-internal(bottom) calibratioof MALDI-TOF MSa,b:correction value;c:corrected value4800 型 MALDI-TOF 質(zhì)譜一級譜數(shù)據(jù)采集使用線型正離子檢測模式，加速電 18.2kV，激光能量 6000，質(zhì)譜信號單次掃描累加 2000 次，，質(zhì)量掃描范圍000~m/z80000。使用 BSA 不同電荷峰校準。數(shù)據(jù)分析軟件為 DE4.5(ABSciex)。 超高分辨質(zhì)譜（Exactive Plus EMR）檢測取各抗體切 N-糖前后樣本各 20μL，10000g 高速離心 5min，取上清進行 LC

圖 2.rhTPO 完整分子的 MALDI-TOF 質(zhì)譜圖a: BSA 校正質(zhì)譜圖;b:校正后質(zhì)譜圖Fig 2.MALDI-TOF MS of intact rhTPOa: mass spectrum after BSA calibration;b: mass spectrum after calibration表 2.rhTPO 切糖前后樣本 BSA 準內(nèi)標(biāo)法的校正結(jié)果比較Tab 2.Comparison of BSA quasi-internal calibration results of rhTPO before and afterglycan removedBtachN-Glycan removedSialic acid of the O-glycanremovedO-Glycan removedAvg.M.W. RSD Error Avg.M.W. RSD Error Avg.M.W. RSD Erro(Da) (%) (%) (Da) (%) (%) (Da) (%) (%)A1 66430.06 0.001 0.0001 66429.18 0.022 0.0012 66431.34 0.011 0.00A2 66430.04 0.004 0.0001 66428.90 0.021 0.0017 66428.57 0.009 0.00A3 66429.94 0.001 0.0001 66429.05 0.040 0.0014 66436.19 0.048 0.00B 66431.92 0.075 0.0029 66426.20 0.051 0.0057 66427.90 0.019 0.00Avg.(Da) 66430.49 66428.33 66429.97
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R917

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 吳侗;楊南萍;;血小板生成素及其受體c-Mpl的作用和信號通路研究進展[J];實用醫(yī)院臨床雜志;2014年03期

2 馬成;潘一廷;張琪;王繼峰;錢小紅;應(yīng)萬濤;;利用親水富集策略分析人血漿中N-糖基化蛋白及N-糖類型[J];色譜;2013年11期

3 張維冰;王智聰;張凌怡;錢俊紅;;柱前衍生超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定仙草多糖組成及其含量[J];分析測試學(xué)報;2013年02期

4 楊曉華;于廣利;趙峽;宋樂天;高昊東;;灰樹花糖蛋白中總糖含量的測定[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2006年06期

5 劉麗,王穎,田生禮,蘆興武,孟巖,劉立忠,謝寶樹,冷愛軍;血小板生成素糖基化與其體內(nèi)生物學(xué)活性關(guān)系的研究[J];免疫學(xué)雜志;1999年02期

本文編號：2699989