【摘要】：背景:白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans,CA)是常見的造成侵襲性真菌血流感染的條件致病菌。近年來,由于三唑類等傳統(tǒng)抗真菌藥物的廣泛使用,耐藥的白色念珠菌的分離率不斷升高,給白色念珠菌感染的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)是芹菜籽油的主要成分之一,臨床上主要用于治療急慢性腦卒中。目前僅有文獻(xiàn)報(bào)道同為芹菜籽提取物的其它丁苯酞結(jié)構(gòu)類似物具有抗念珠菌活性,尚無關(guān)于丁苯酞抗真菌活性的研究報(bào)道。目的:評(píng)價(jià)丁苯酞在體內(nèi)和體外對(duì)白色念珠菌的抗真菌作用,并探討其潛在的抗真菌機(jī)制。方法:采用標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法測定丁苯酞單用及與氟康唑(Fluconazole,FLC)聯(lián)用對(duì)白色念珠菌浮游菌的作用,用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration index,FICI)評(píng)價(jià)兩藥聯(lián)用的相互作用結(jié)果;采用比色法測定丁苯酞對(duì)預(yù)先形成的不同階段生物膜的作用;通過繪制時(shí)間殺菌曲線,評(píng)估丁苯酞對(duì)白色念珠菌的動(dòng)態(tài)抗真菌作用。采用大蠟螟-白色念珠菌侵染模型,通過測定感染大蠟螟幼蟲的生存率、體內(nèi)真菌載菌量和組織病理學(xué)變化，評(píng)價(jià)丁苯酞的體內(nèi)抗真菌作用。采用卵黃培養(yǎng)基測定白色念珠菌胞外磷脂酶活性,顯微鏡觀察菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換,評(píng)價(jià)丁苯酞干預(yù)后白色念珠菌毒力因子的變化;采用熒光探針DCFH-DA和羅丹明123測定丁苯酞干預(yù)后白色念珠菌胞內(nèi)活性氧水平和線粒體膜電位;采用熒光探針羅丹明6G,測定丁苯酞對(duì)白色念珠菌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的影響,探討丁苯酞和氟康唑協(xié)同抗真菌機(jī)制。結(jié)果:(1)丁苯酞單用具有抗白色念珠菌作用,與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌具有協(xié)同抗真菌作用丁苯酞對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的六株白色念珠菌均表現(xiàn)出抗真菌作用,MIC值均為128μg/mL。當(dāng)與氟康唑合用時(shí),丁苯酞可將耐藥白色念珠菌對(duì)氟康唑的MIC值從512 μg/mL降至0.25-1 μg/mL，，F(xiàn)ICI值均0.5,表現(xiàn)出強(qiáng)烈的協(xié)同作用。隨后,時(shí)間殺菌曲線證實(shí)了丁苯酞對(duì)白色念珠菌的動(dòng)態(tài)抗真菌作用。(2)丁苯酞單用具有抗白色念珠菌預(yù)形成生物膜的作用,與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌預(yù)形成的生物膜具有協(xié)同抗真菌作用丁苯酞對(duì)預(yù)形成時(shí)間不超過12 h的生物膜具有抑制作用,sMIC值為128-256μg/mL,但對(duì)預(yù)形成24 h的生物膜沒有活性。此外,和氟康唑聯(lián)用時(shí),對(duì)于耐藥白色念珠菌預(yù)形成時(shí)間不超過12h的生物膜,丁苯酞可將其對(duì)氟康唑的sMIC值從1024μg/mL降至0.5-8μg/mL,FICI值均0.5,表現(xiàn)出強(qiáng)烈的協(xié)同作用。但兩藥聯(lián)用對(duì)敏感白色念珠菌形成的各階段的生物膜和所有白色念珠菌預(yù)形成24 h的成熟生物膜表現(xiàn)為無關(guān)作用。(3)丁苯酞和氟康唑聯(lián)用對(duì)白色念珠菌感染的大蠟螟幼蟲具有協(xié)同抗真菌作用丁苯酞單用即可對(duì)白色念珠菌感染的大蠟螟幼蟲表現(xiàn)出一定的體內(nèi)抗真菌作用,然而,當(dāng)丁苯酞和氟康唑聯(lián)用時(shí),治療作用明顯增強(qiáng)。藥物聯(lián)用可顯著提高感染后的大蠟螟幼蟲的生存率,減少幼蟲體內(nèi)的真菌載菌量,減弱白色念珠菌對(duì)幼蟲組織的病理學(xué)損傷。說明丁苯酞可以逆轉(zhuǎn)感染白色念珠菌后的幼蟲對(duì)氟康唑的耐藥性,表現(xiàn)出體內(nèi)協(xié)同抗真菌作用。(4)丁苯酞減弱白色念珠菌的毒力因子丁苯酞可以顯著降低白色念珠菌胞外磷脂酶活性，使白色念珠菌由分泌極高活性的磷脂酶轉(zhuǎn)變?yōu)榉置诘突钚缘牧字�。此�?丁苯酞還可以抑制白色念珠菌由酵母相向菌絲相的形態(tài)轉(zhuǎn)換,且隨著濃度的升高,抑制作用逐漸增強(qiáng)。說明丁苯酞通過減弱白色念珠菌毒力因子進(jìn)而發(fā)揮抗真菌作用。(5)丁苯酞引發(fā)白色念珠菌胞內(nèi)活性氧蓄積以及降低線粒體膜電位隨著丁苯酞藥物濃度的升高,白色念珠菌胞內(nèi)活性氧水平升高,同時(shí),線粒體膜電位下降,具有低線粒體膜電勢(shì)的白色念珠菌細(xì)胞比例顯著增多。說明丁苯酞通過誘發(fā)胞內(nèi)活性氧蓄積,造成線粒體膜電位去極化進(jìn)而發(fā)揮抗真菌作用。(6)丁苯酞抑制白色念珠菌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性丁苯酞顯著促進(jìn)白色念珠菌對(duì)氟康唑的吸收,抑制細(xì)胞膜上藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性。使胞內(nèi)氟康唑外排減少,提高白色念珠菌胞內(nèi)氟康唑的濃度,進(jìn)而和氟康唑聯(lián)用對(duì)白色念珠菌發(fā)揮協(xié)同抗真菌作用。結(jié)論:丁苯酞具有在體外抑制白色念珠菌浮游菌及預(yù)形成的生物膜的活性的作用,且和氟康唑合用發(fā)揮協(xié)同抗真菌活性。此外,丁苯酞和氟康唑聯(lián)用可延長白色念珠菌感染的大蠟螟侵染模型幼蟲的生存率,降低幼蟲體內(nèi)真菌載菌量以及減少白色念珠菌對(duì)幼蟲組織的損傷,表現(xiàn)出體內(nèi)抗真菌活性。機(jī)制研究表明,丁苯酞抗白色念珠菌作用與減弱白色念珠菌重要毒力因子,包括磷脂酶活性和菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換,誘發(fā)胞內(nèi)活性氧聚集和線粒體膜電位降低以及抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵活性有關(guān)。
【圖文】：

（圖１）邋［８］。當(dāng)菌體黏附于宿主后，菌體出芽形假菌絲寬度比菌絲窄且菌絲體中無縊痕［９，１Ｄ］。白色念珠菌可以獲得營養(yǎng)，同時(shí)菌絲或假菌絲侵襲性和傳染性都會(huì)增加，加劇了對(duì)宿主細(xì)胞染宿主時(shí)，易在器官表面形成生物膜。生物膜有天然抗性，不易被清除，而白色念珠菌菌絲形成的過程往往也伴隨著生物膜的形成［８］，因形態(tài)轉(zhuǎn)換也是白色念珠菌致病性產(chǎn)生的重要毒

本部分實(shí)驗(yàn)以耐藥白色念珠菌ＣＡ１０為代表菌株。以不同時(shí)間不同體系的菌逡逑液濃度為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉＳｍ７軟件繪制丁苯酞單用及逡逑與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌ＣＡ１０的時(shí)間殺菌曲線（圖３）。逡逑ａ邐ｂ逡逑８－１邋８－１逡逑奪邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邐令邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｌｊ邋７－邐＾邐？邋６４ｐｇ／ｍＬ邐Ｌ邋７－邐＾邐、’ＢＰ逡逑＝邐１２８Ｍｇ／ｍＬ邐＝邐ＦＬＣ逡逑＆邋６＇邋Ｊ邐－＊■邋２５６Ｍｇ／ｍｌ．邐＆邋６．邋／Ｔ邐ＮＢＰ＋ＦＬＣ逡逑｜５＜＾￣邐邋１－＾—邐邐．逡逑０邐１２邐２４邐３６邐４８邐０邐１２邐２４邐ｉ６邐４８逡逑Ｔｉｍｅ（ｈ）邐Ｔｉｍｅ（ｈ）逡逑圖３邋丁苯酞單用（ａ）及和氟康唑聯(lián)用（ｂ）對(duì)白色念珠菌ＣＡ１０的時(shí)間殺菌曲線。菌懸液逡逑濃度為１0５邋ＣＦＵ／ｍＬ。（ａ）丁苯酞單用時(shí)，濃度分別為６４，邋１２８和２５６邋ｎｇ／ｍＬ。（ｂ）丁苯酞和氟逡逑康唑聯(lián)用時(shí)，濃度分別為１２８和１邋（ｉｇ／ｍＬ。（見實(shí)驗(yàn)記錄０００５５１３ｐ３４－ｐ３５，邋ｐ３８－ｐ３９，邋ｐ４１－ｐ４２，逡逑ｐ６７－ｐ６８）逡逑由圖可知，丁苯酞單用時(shí)，當(dāng)藥物濃度為６４和１２８邋Ｍｇ／ｍＬ，白色念珠菌時(shí)逡逑間生長曲線基本與生長對(duì)照組重合，但當(dāng)丁苯酞濃度提高至２５６邋ｐｇ／ｍＬ，培養(yǎng)６邋ｈ逡逑后，白色念珠菌的生長明顯被抑制。和生長對(duì)照組相比，２５６邋ｐｇ／ｍＬ邋丁苯酞可使逡逑２４和４８邋ｈ的菌液濃度分別減少１．９１邋ｌｇｌＯ和２．０５邋ｌｇｌＯ邋ＣＦＵ／ｍＬ。對(duì)于藥物聯(lián)用組，逡逑濃度為１邋ｐｇ／ｍＬ的氟康唑藥液略抑制白色念珠菌的生長
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2699974