【摘要】：熱休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)是ATP依賴的分子伴侶蛋白,參與客戶蛋白的構(gòu)象成熟和功能穩(wěn)定,防止蛋白經(jīng)由泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。在Hsp90調(diào)控的客戶蛋白中,有很多是致癌信號通路中的原癌基因表達蛋白或重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,參與調(diào)控腫瘤細胞的基本特征,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。因此,針對Hsp90單一靶點的單一用藥抑制其伴侶功能,導(dǎo)致多種客戶蛋白的降解,多重阻斷腫瘤信號通路,最終摧毀腫瘤賴以生存的整個信號通路網(wǎng)絡(luò),能夠同時拮抗多個甚至全部腫瘤細胞的標志性特征,有效減少藥物耐受。在充分調(diào)研文獻的基礎(chǔ)上,針對Hsp90蛋白N端ATP結(jié)合域的三維結(jié)構(gòu)及Hsp90與其抑制劑的作用模式進行了深入的研究。采用基于片段的藥物設(shè)計(FBDD)方法,選取根赤殼霉素的5-氯-2,4-二羥基苯甲酸片段,以四氫異喹啉-3-羧酸為骨架,設(shè)計、合成了(S)-Tic(A1-13)和(R)-Tic(B1-13)兩個系列的化合物。抗腫瘤細胞增殖活性實驗揭示了目標化合物的構(gòu)效關(guān)系,含手性(R)-Tic骨架的分子活性更高。CETSA靶向Hsp90α活性篩選結(jié)果印證了抗腫瘤細胞增殖活性實驗結(jié)果,(R)-Tic骨架的B系列化合物靶向Hsp90α,而且其芳香側(cè)鏈提高化合物的活性。兩輪活性篩選結(jié)果表明,含(R)-Tic骨架的化合物B7呈現(xiàn)最強的抗腫瘤細胞增殖活性和最佳的靶向Hsp90α活性。CETSA“熔化曲線”和ITDRFCETSA(等溫劑量反應(yīng))曲線證實化合物B7在胞內(nèi)直接與Hsp90α結(jié)合。此外,如同公認的Hsp90抑制劑GA,化合物B7同樣能夠引起Hsp90客戶蛋白水平下調(diào)和Hsp70水平上調(diào),進一步證實了化合物B7靶向Hsp90。分子模擬結(jié)果闡明了化合物B7活性最佳的原因,(R)-Tic骨架維持小分子獨特的活性構(gòu)象,芐胺側(cè)鏈深入誘導(dǎo)疏水口袋,與氨基酸殘基Phe138形成π-π相互作用。所有的這些特性保證化合物B7是一個可靠的Hsp90抑制劑的先導(dǎo)化合物。為了提高先導(dǎo)化合物B7芐胺側(cè)鏈與疏水口袋的空間適配,我們設(shè)計、合成了 C系列側(cè)鏈苯環(huán)取代衍生物和D系列側(cè)鏈芳雜環(huán)衍生物�；钚院Y選實驗顯示芳環(huán)取代基的種類、個數(shù)、位置顯著影響化合物的活性。芳環(huán)對位單取代的氫鍵受體取代基有利于提高化合物活性,其中含對位吡啶基的化合物D4活性最佳。CETSA“熔化曲線”和ITDRFCETSA曲線證實化合物D4在胞內(nèi)直接與Hsp90α結(jié)合。此外,同GA 一樣,化合物D4同樣能夠引起Hsp90客戶蛋白水平下調(diào)和Hsp70水平上調(diào),進一步證實了化合物D4靶向Hsp90。分子模擬結(jié)果闡明了化合物D4活性最佳的原因,5-氯-2,4-二羥基苯甲�；闻cHsp90 口袋底部結(jié)合,(R)-Tic骨架維持D4獨特的活性構(gòu)象,酰胺側(cè)鏈深入誘導(dǎo)疏水口袋,吡啶環(huán)不僅與氨基酸殘基Phe]38形成π-π相互作用,而且與氨基酸殘基Tyr139形成氫鍵結(jié)合�？鼓[瘤細胞增殖活性普篩實驗表明化合物D4具有廣譜的抗腫瘤細胞增殖活性,并且這種活性呈現(xiàn)時間與濃度依賴性。在MDA-MB-453細胞中,D4誘導(dǎo)細胞G0/G1期阻滯。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)和western blot實驗證實D4誘導(dǎo)MDA-MB-453細胞凋亡。在NF-κB信號途徑中IKK是關(guān)鍵激酶。Hsp90抑制劑D4不僅降低IKK的蛋白水平,而且還能通過磷酸化Hsp27降低IKK的生物活性。通過對IKK的調(diào)控,D4成功地抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的活化。綜上所述,化合物D4是一個可靠的Hsp90抑制劑,具有進一步探索其生物作用機制的價值�；衔顳4的進一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化集中在四氫異喹啉片段�；衔顳4的分子模擬結(jié)果顯示四氫異喹啉的苯環(huán)臨近Lys58并且朝向溶劑暴露區(qū),就此兩種優(yōu)化策略產(chǎn)生E系列化合物和F系列化合物。期望與Lys58產(chǎn)生氫鍵作用提高靶向活性,同時優(yōu)化物理化學(xué)性質(zhì)和藥代動力學(xué)行為,提高用藥安全性。目前,這兩個系列化合物的合成及活性篩選工作已完成,抗腫瘤機制研究正在進行中。綜上,本課題基于Hsp90 N端ATP結(jié)合域的三維結(jié)構(gòu)及抑制劑與Hsp90的作用模式,綜合應(yīng)用藥物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、計算機化學(xué)等前沿學(xué)科,合理設(shè)計、合成了系列的四氫異喹啉-3-羧酸類化合物。引入細胞熱轉(zhuǎn)變分析(CETSA)檢驗化合物的靶向性,并對代表性化合物進行了深入的機制研究。本課題的研究內(nèi)容拓展了 Hsp90抑制劑的結(jié)構(gòu)類型,為下一代抑制劑的研發(fā)提供了借鑒意義。
【圖文】：

圖１．１８候選藥物ＮＹＰ－ＨＳＰ９９０的研發(fā)示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１８邋Ｒｅｓｅａｒｃｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋ｓｋｅｔｃｈ邋ｏｆ邋ｃａｎｄｉｄａｔｅ邋ｄｒｕｇ邋ＮＶＰ－ＨＳＰ９９０逡逑（３）苯甲酷胺類Ｈｓｐ９０抑制劑逡逑小分子ＳＮＸ－５４２２起源于高通量篩選得到的先導(dǎo)化合物６邋［１９３］�；衔铮杜c逡逑Ｈｓｐ９０有中等的親和力（Ｋａ邋＝邋３．７ｐＭ），，細胞毒性差（ＩＣ５Ｑ＞５０＾Ｍ）。Ｘ射線晶逡逑體衍射發(fā)現(xiàn)化合物６的苯甲酰胺結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基Ａｓｐ９３、Ｔｈｒｌ８４形成氫鍵作逡逑用，吲哚酮片段驅(qū)使Ｌｅｕｌ０７移位，誘導(dǎo)產(chǎn)生疏水口袋，這與ＰＵ系列化合物相逡逑同，并且吲哚酮的羰基氫鍵結(jié)合Ｔｙｒｌ３９（Ｆｉｇｕｒｅｌ．ｌ９Ｂ）。在化合物６共晶結(jié)構(gòu)的逡逑指導(dǎo)下，首先對苯環(huán)２位進行惻鏈修飾。檢測結(jié)果表明以ＮＨ作為鄰位惻鏈ｌｉｎｋｅｒ逡逑能夠與酰胺羰基形成分子內(nèi)氫鍵，利于活性提高。烷基和芳基取代與Ｍｅｔ９８存在逡逑疏水相互作用。此外，化合物７的含氧惻鏈還與Ｌｙｓ５８形成氫鍵作用。吲哚酮２逡逑位甲基移位至３位可增強化合物活性。在化合物８的分子結(jié)構(gòu)中，對胺基苯氧結(jié)逡逑

圖...目由招乍臼月
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R91;R96


本文編號：2696904