【摘要】：【研究背景】雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類強效免疫抑制劑,具有抗真菌?抑制腫瘤生長?特異性抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白活性的作用?異位骨化(Heterotopic ossification,HO)是指在正常骨骼系統(tǒng)之外(常見如肌肉?跟腱?關(guān)節(jié)囊等軟組織)出現(xiàn)異常的真性骨組織?異位骨化目前主要分為兩種:一種是遺傳性HO,發(fā)病率低但是癥狀嚴重且死亡率高,包括由ACVR1發(fā)生激活性突變的進行性肌肉骨化癥(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva,FOP)以及編碼G蛋白a亞基的GNAS基因發(fā)生失活突變引起的進行性骨發(fā)育異常(Progressive Osseous Heteroplasia,POH);另一種是獲得性HO,相對于遺傳性HO來說,癥狀較輕,死亡率低,但是發(fā)病率高,患者癥狀的輕重往往與創(chuàng)傷的嚴重程度成正比,且與創(chuàng)傷部位以及創(chuàng)傷來源密切相關(guān),常見的創(chuàng)傷來源包括如槍傷?爆炸等的戰(zhàn)斗中損傷,如髖關(guān)節(jié)置換術(shù)等手術(shù)引起的損傷,脊髓神經(jīng)系統(tǒng)受損,較嚴重的大面積燒傷等?相對而言,國際上對于遺傳性HO的致病機理研究得較為廣泛,一些針對潛在的致病因素的藥物逐漸涌現(xiàn),如維甲酸受體γ激動劑帕拉羅汀,被廣泛使于FOP的患者,且療效較好?但是縱觀目前對HO研究的大環(huán)境,針對性的研究創(chuàng)傷性HO的文獻還是相對較少的,雖然學(xué)者們做過一些相關(guān)的信號通路的研究,但是目前還不能完全理順創(chuàng)傷性HO的致病機制的因果關(guān)系和整個的病因鏈,所以對于創(chuàng)傷性HO的治療方法相對來說比較匱乏?因此,我們課題組主要致力于研究創(chuàng)傷性HO的致病機制與治療方法?創(chuàng)傷性HO的治療方法已經(jīng)漸漸成為熱點,比如說手術(shù)切除,脈沖低強度電磁場,皮質(zhì)類固醇類?NSAIDS藥物、二磷酸鹽類治療等,但是這些治療措施結(jié)果不穩(wěn)定,副作用較大,機理也不太明確。故此,我們希望在這方面能夠有所突破。我們選擇mTOR蛋白特異性抑制劑RAPA作為研究的重心?RAPA所具備的強效免疫抑制作用已經(jīng)在臨床上被用于多種疾病的治療,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡?中風(fēng),肺癌等?另外,RAPA還具有調(diào)節(jié)細胞自噬,抑制異體移植可能會出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)?RAPA用于HO的作用是近幾年才開始被發(fā)現(xiàn)的?現(xiàn)在還不知RAPA是否還參與調(diào)節(jié)其他信號通路來抑制HO的發(fā)生和發(fā)展?作用機理到底是什么?【研究方法】1.建立AHO模型:實驗開始之前,選取數(shù)量(各5只)?性別?年齡(成年,一般在3~4周)?窩別?體重?活動情況等因素相匹配的NSE-BMP4實驗小鼠,分為對照組和實驗組?在實驗第一天,所有小鼠左腿肌肉注射一次等量的的(100ng/100μl)的心臟毒素(cardiotoxin,CTX)作為損傷條件,以損傷1周?2周?4周的組織作為創(chuàng)傷性HO的早?中?后期階段來觀察,以此創(chuàng)建創(chuàng)傷性HO的小鼠模型?2.給藥:實驗組小鼠在用CTX損傷后,腹腔注射已被溶解和稀釋的RAPA(100μg/100μl),每隔一天給藥一次,對照組給予溶劑,給藥劑量?方法?時間等情況與實驗組小鼠相同?3.X光:給藥結(jié)束后,將實驗鼠在麻醉的情況下于小動物成像儀(型號FX PRO)里進行X光拍攝,觀察損傷部位異位骨生長情況,比較實驗組和對照組的差異?4.對小鼠進行眼球取血:于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科進行WBC數(shù)目和分型檢測(日本希森美康XS-800i五分類血細胞分析儀)?5.免疫熒光檢測:取HO不同時相的小鼠損傷部位組織,先制作成冰凍切片,然后選取特異的靶蛋白的抗體以及相應(yīng)的熒光二抗進行免疫熒光染色?6.組織Western Blot:檢測實驗組和對照組小鼠的損傷部位組織中靶蛋白如Hif1a的表達差異?【研究結(jié)果】1.影像學(xué)結(jié)果顯示:與對照組相比,給予RAPA的實驗組經(jīng)損傷后出現(xiàn)的異位骨明顯減少,并在一定的劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性?2.外周血白細胞計數(shù)和分型檢測結(jié)果顯示:相比較于對照組,給予RAPA的實驗組外周血WBC明顯降低,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?3.免疫熒光結(jié)果顯示:RAPA可以降低損傷部位P-mTOR的表達?4.RAPA可以通過抑制Hif1a的表達來抑制HO?5.氧化應(yīng)激伴隨著異常免疫反應(yīng)參與HO早期的纖維增生階段的進展?6.RAPA可以降低HO損傷區(qū)域中血管的形成?【結(jié)論】氧化應(yīng)激伴隨著異常免疫反應(yīng),參與HO的早期階段,而雷帕霉素可以通過降低mTOR蛋白的表達,緩解低氧環(huán)境,抑制mTOR信號和氧化應(yīng)激來抑制HO的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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