【摘要】：[背景]肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是一種全球最常見的肝原發(fā)性惡性腫瘤,其具有起病隱匿、發(fā)病率高、生長迅速、侵襲性強、致死率高、預后差等特點,目前尚缺乏有效的治療手段。對于中晚期肝癌來說,除局部治療具有短期療效外,索拉菲尼是當前唯一被批準用于臨床的靶向性治療藥物,然而快速耐藥性的產(chǎn)生嚴重限制其臨床療效。HCC對化療藥物的敏感性低于許多其他腫瘤,其化療抗性是藥物治療HCC失敗的主要原因之一,且其發(fā)生機制極為復雜。因此迫切需要深入研究HCC的病理機制及化療抗性背后的新干預靶標,并研發(fā)安全有效的新型癌癥治療藥物具有重大意義。近年來,金屬藥物在治療各種癌癥方面取得了顯著療效,其中鉑類配合物已在臨床上有不同程度的應用。然而,由于耐藥性等副作用的產(chǎn)生,尋找抗腫瘤活性強、毒性低且能克服耐藥性的配合物是目前配合物藥物研究的關鍵。銅配合物的生理分布、細胞內(nèi)聚集及抑制腫瘤細胞生長的過程與鉑配合物均有不同程度的差異,為銅配合物作為抗腫瘤藥物克服耐藥性帶來了可能。本課題研究組前期發(fā)現(xiàn),三吡啶類銅配合物可以有效地與腫瘤細胞DNA結合,并通過氧化切割原理將DNA切割成不同組分,但是并不足以明顯改變腫瘤細胞的惡性生物學行為,原因可能是腫瘤細胞可以及時地對DNA損傷進行修復,這也是耐藥性產(chǎn)生的原因之一。為了進一步優(yōu)化上述三吡啶類銅配合物,課題組首次將線粒體靶向基團三苯基膦(Tri-phenyl-phosphine,TPP)引入該配合物中得到一種全新的銅配合物[Cu(ttpy-tpp)Br2]Br(以CTB表示),TPP可以為該配合物增加離域電荷,同時其親脂性的特性有利于聚集到線粒體上。通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP)等確證了CTB具有明顯的線粒體靶向功能,且具有良好的水溶性及DNA切割活性。然而,CTB靶向腫瘤細胞線粒體表現(xiàn)出抗腫瘤活性的作用及分子機制尚不完全清楚,亟需進一步深入探究。本研究旨在明確CTB對肝細胞癌的抗腫瘤效應,并闡明其作用作用的分子機理,為今后線粒體靶向性配合物藥物的設計及臨床應用提供理論依據(jù)。[方法]本論文研究采用體外、體內(nèi)兩部分實驗進行開展:1、體外研究主要選取人肝癌細胞SMMC-7721細胞為研究對象。首先以MTT法篩選CTB最適用藥濃度、檢測對肝癌細胞的增殖抑制作用;以透射電鏡、Janus green染色、JC-1染色法考察CTB對SMMC-7721細胞線粒體結構的影響;后利用海馬XF96(Seahorse)細胞外流量分析儀檢測耗氧率、外酸化率等來測定線粒體功能的變化;再采用AnnexinV-FITC/PI染色、TUNEL染色,檢測CTB對肝癌細胞凋亡的作用;以DCFH-DA染色法檢測肝癌細胞內(nèi)ROS的堆積;透射電鏡、MDC熒光、質粒轉染等手段檢測肝癌細胞自噬的發(fā)生;利用線粒體熒光探針考察CTB對線粒體分裂的影響;利用免疫熒光雙染、Western blot檢測目的蛋白表達與活化。2、體內(nèi)研究采購體重約18-22g的4周齡雄性裸鼠(BALB/c-nu/nu),以建立人肝癌SMMC-7721細胞裸鼠異種移植瘤模型。成功構建后,卡尺定期測量腫瘤大小,建立生長曲線。通過游標卡尺測量長直徑(a)和短直徑(b),并且通過公式計算腫瘤體積,即體積(V)=a×b2/2。當腫瘤達到時平均大小為150 mm3,根據(jù)實驗所需將小鼠隨機分組(每組8只動物)。采用腹腔注射藥物,藥物CTB懸浮于無菌PBS中并每周注射3次,共兩周。實驗結束后,分離完整腫瘤、肝臟等器官并稱重,拍攝腫瘤并稱重以計算腫瘤抑制率。將腫瘤組織部分切除固定在4%多聚甲醛中用于IHC/IF檢測,或固定在2.5%戊二醛中用于透射電鏡檢測,剩余部分于液氮中冷凍用于Western blot檢測。[結果]體外研究結果顯示,CTB以時間、劑量依賴性方式抑制多種肝癌細胞的生長。透射電鏡、Janus green染色、JC-1染色等檢測結果顯示,CTB破壞線粒體結構、導致線粒體膜電位的下降,同時細胞外酸化率、氧消耗率檢測結果顯示CTB抑制肝癌細胞糖酵解及氧消耗水平。AnnexinV-FITC/PI染色、TUNEL染色結果顯示CTB誘導肝癌細胞凋亡,伴隨著肝癌細胞內(nèi)ROS的堆積以及p53蛋白的線粒體轉位。透射電鏡、MDC熒光等檢測結果顯示CTB能夠提高肝癌細胞自噬水平;GFP-LC3熒光報告基因顯示LC3-Ⅱ的活化,同時CTB激活自噬AMPK/mTOR/ULK1信號通路;線粒體和溶酶體的熒光共定位檢測顯示線粒體自噬的發(fā)生,并伴隨著線粒體自噬蛋白Parkin/PINK1表達的升高。進一步的Mito-tracker Green熒光檢測顯示CTB誘導線粒體的過度分裂,并伴隨著線粒體分裂蛋白Drp1的活化;Drp1特異性抑制劑Mdivi-1在抑制線粒體分裂的同時降低線粒體自噬蛋白的表達,削弱CTB對線粒體自噬的誘導。最后的檢測結果顯示,自噬抑制劑3-MA抑制CTB誘導的肝癌細胞線粒體功能障礙;Mdivi-1抑制CTB誘導的p53線粒體轉位及凋亡水平,細胞自噬的誘導對CTB誘導的細胞凋亡具有一定的促進作用。體內(nèi)研究結果顯示,CTB處理后人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織質地較硬、發(fā)白,抑瘤率及生長曲線結果顯示CTB以劑量依賴性方式抑制腫瘤組織的生長;TUNEL染色、凋亡相關因子的檢測結果顯示CTB誘導能夠誘導腫瘤組織的凋亡。同時,CTB增加腫瘤組織中自噬標志蛋白LC3-Ⅱ、Parkin、PINK1的水平,降低p62的水平;Drp1抑制劑Mdivi-1能夠削弱這些效應,線粒體分裂的抑制能夠影響自噬過程。[結論]體內(nèi)、體外研究實驗結果充分說明,CTB具有良好抗肝癌活性,與其線粒體靶向特性密不可分。CTB誘導肝癌細胞線粒體功能障礙,并通過ROS依賴性的p53線粒體轉位誘導線粒體凋亡的發(fā)生,從而發(fā)揮其抗腫瘤效應。CTB通過Drp1依賴性的線粒體分裂促進線粒體自噬的發(fā)生,并在CTB誘導的線粒體凋亡中發(fā)揮一定的促進作用。本研究為靶向調控線粒體功能的抗肝癌細胞治療藥物的研發(fā)提供了一定的實驗依據(jù)。
【圖文】：

的線粒體靶向能力，且對線粒體ＤＮＡ造成明顯的方式不同［２Ｇ］。銅配合物就己被證明具有輻射保護和力，并能迅速地從輻射引發(fā)組織變化中恢復過來，有關［２１，２２］。在很多研究中，銅配合物的毒活性多與配體對腫瘤具有明顯毒活性，但是銅配合物的配體中地基團的研究仍然較少。因此，對于具有靶向性銅配點。逡逑線粒體靶向銅配合物逡逑組前期研究發(fā)現(xiàn)，三吡啶類銅配合物可以有效地與ＤＮＡ切割成不同組分［２３］。但單純切割ＤＮＡ并不足為。近年來研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過改造后的銅配合物不僅與體中的某些蛋白結合，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤效應。物，將三苯基膦（ＴＰＰ）引入配合物結構中ｐｐ）Ｂｒ２］Ｂｒ邋（以邋ＣＴＢ邋表本）［２４］。逡逑

－ｇ詞養(yǎng)在無菌條件下，提供１２邋ｈ光－暗循環(huán)照射、足夠的水和食物。為了建植模型，在對數(shù)期收獲ＳＭＭＣ－７７２１細胞，并以ｌｘｌ0７／２００ｐＬ濃度的細胞小鼠的右腋下以誘導腫瘤生長。細胞移植后，生長約五天觀察模型是否卡尺測量腫瘤大小，并且每３天估計腫瘤體積。為了建立生長曲線，通過直徑Ｕ）和短直徑（ｂ），并且通過公式計算腫瘤體積，即體積（Ｖ）邋＝ａｘｂ到時平均大小為１５０邋ｍｍ３，，將小鼠隨機分成五組（每組８只動物）：正常ｓ－Ｐｔ邋（１０ｍｇ／ｋｇ）＿邋陽性藥對照組、ＣＴＢ邋治療低（２．５邋ｍｇ／ｋｇ）、中（５邋ｍｇ／ｋｇ）、）劑量組。采用腹腔注射藥物，ＣＴＢ、Ｃｉｓ－Ｐｔ懸浮于無菌ＰＢＳ中并每周注型組接受相同體積的鹽水，注射兩周。每３天記錄體重、量取腫瘤大小。逡逑驗結束后，每只大鼠稱重并腹腔注射１０％水合氯醛（３５０邋ｍｇ／ｋｇ）麻醉，離完整腫瘤、肝臟等器官并稱重，拍攝腫瘤并稱重以計算腫瘤抑制率。抑制組的平均腫瘤重量－治療組的平均腫瘤重量）／對照組的平均腫瘤重量ｘｌ組織的部分切除在４％多聚甲醛中固定用于ＩＨＣ等測定，部分切除固定于剩余部分于液氮中冷凍。逡逑
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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