發(fā)布時(shí)間：2020-05-29 09:45

【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和僵直,嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量。髓系細(xì)胞白血病-1基因(MCL-1)siRNA可以通過抑制巨噬細(xì)胞中MCL-1的表達(dá)引起巨噬細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而抑制RA的進(jìn)程,且其毒性較小,但是MCL-1 siRNA不能及時(shí)的緩解RA患者的炎癥和疼痛。地塞米松(Dex)是一種經(jīng)典的治療RA的藥物,能夠快速的緩解RA患者的疼痛和炎癥,但是由于Dex需要長期高劑量的給藥,常常帶來全身毒副作用。因此我們推測(cè)MCL-1 siRNA和Dex聯(lián)合用藥能夠在增加療效的同時(shí)減少全身毒副作用。在RA發(fā)病部位會(huì)有大量巨噬細(xì)胞聚集,這些巨噬細(xì)胞可以通過分泌促炎細(xì)胞因子加劇RA的進(jìn)程,因此,抑制RA發(fā)病部位的巨噬細(xì)胞是治療RA的一個(gè)關(guān)鍵。RA發(fā)病部位的巨噬細(xì)胞活化后其表面會(huì)過量表達(dá)CD44,CD44能與透明質(zhì)酸(HA)特異性結(jié)合,因此HA可以作為治療RA的靶向配體。在細(xì)胞中,溶酶體的pH值為4.5-5.0,早期核內(nèi)體的pH值為5.0-6.0,晚期核內(nèi)體的pH值為4.5-5.0,而胞漿中的pH值則為7.4。針對(duì)這種特點(diǎn),我們?cè)O(shè)計(jì)了酸敏感的納米載體。聚縮酮是一類新型的酸敏感聚合物,其在酸性環(huán)境中可以快速降解成中性小分子,因而可以作為RA發(fā)病部位藥物傳遞的優(yōu)良載體。因此,本文擬設(shè)計(jì)一種以聚縮酮為核心,HA靶向的酸敏感納米載體,共傳遞MCL-1 siRNA和Dex治療RA。本文分別以兩種聚縮酮(PCADK和PK3)為納米載體核心,外部連接HA作為靶向基團(tuán),包載Dex、siRNA或者兩者藥物組合。通過建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,考察納米載體對(duì)RA大鼠的作用。本研究一共分為以下三個(gè)部分:1.HA靶向的Dex酸敏感納米載體(HAPNPs/Dex)的制備與評(píng)價(jià)本部分研究以PCADK為納米載體核心,添加聚乙烯亞胺(PEI)與蛋黃卵磷脂(egg PC),用HA修飾納米載體。以PEI加入量、egg PC加入量、HA加入量作為處方優(yōu)化的條件,優(yōu)選得到的納米載體配方為PCADK 20 mg,PEI 1 mg,egg PC 8 mg,0.1%HA 500μL。通過納米粒度電位儀測(cè)定HAPNPs/Dex的粒徑為150.5±2.47 nm,zeta電位為-2.84±0.53 mV,HAPNPs/Dex的實(shí)際載藥量為7.26±0.71%。細(xì)胞攝取以及細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明HAPNPs/Dex能夠特異性的靶向到活化的巨噬細(xì)胞并殺傷巨噬細(xì)胞,而對(duì)非活化的巨噬細(xì)胞增殖沒有顯著影響。體外釋放結(jié)果表明在酸性條件下HAPNPs/Dex中Dex的釋放速率明顯快于在中性條件下,說明HAPNPs/Dex具有酸敏感特性。在動(dòng)物體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)中,HAPNPs/Dex能有效的減少炎癥細(xì)胞,減輕軟骨破壞,減少促炎細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而抑制RA的進(jìn)程。2.載MCL-1 siRNA的酸敏感納米載體(HAPKPNPs/siRNA)的制備與評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)首先建立了MCL-1 siRNA的體外分析方法,通過Cy5標(biāo)記MCL-1siRNA(Cy5-siRNA),并用熒光分光光度計(jì)建立Cy5-siRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明Cy5-siRNA的熒光強(qiáng)度與濃度線性關(guān)系良好。隨后將氫化大豆卵磷脂(DOTAP)與MCL-1 siRNA連接形成穩(wěn)定復(fù)合物(DOTAP-siRNA),并以酸敏感特性更強(qiáng)的PK3作為納米載體核心,對(duì)egg PC的加入量,DOTAP-siRNA的量和HA的加入量進(jìn)行處方優(yōu)化,得到最優(yōu)處方為PK3 20 mg,egg PC 6 mg,DOTAP-siRNA 1.5 nM,0.1%HA 200μL。測(cè)定HAPKPNPs/siRNA的粒徑為115.56±5.44 nm,zeta電位為11.38±0.98 mV,載藥量為5.43±0.003%,包封率為95.09±0.05%。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明HAPKPNPs/siRNA能夠促進(jìn)活化的巨噬細(xì)胞凋亡。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明HAPKPNPs/siRNA在酸性環(huán)境釋放速率更快,說明HAPKPNPs/siRNA具有酸敏感特性。RA大鼠模型體內(nèi)藥效結(jié)果表明,HAPKPNPs/siRNA能夠減少部分炎癥細(xì)胞,抑制部分促炎細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而抑制RA的進(jìn)程。3.共傳遞MCL-1 siRNA與Dex的透明質(zhì)酸靶向酸敏感納米載體(HAPKNPs/(Dex+siRNA))的制備與評(píng)價(jià)通過第2部分的方法制備HAPKNPs/(Dex+siRNA),測(cè)定其粒徑為117.07±2.21 nm,zeta電位為15.53±1.06 mV,其中MCL-1 siRNA的載藥量為4.34±0.026%,包封率為93.33±5.51%,Dex載藥量為5.03±0.13%,包封率為40.55±2.32%。體外釋放結(jié)果表明HAPKNPs/(Dex+siRNA)具有酸敏感特性。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明HAPKNPs/(Dex+siRNA)對(duì)活化的巨噬細(xì)胞殺傷效果強(qiáng)于兩種單載的納米載體。動(dòng)物體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種單載的納米載體對(duì)RA的抑制作用明顯弱于HAPKNPs/(Dex+siRNA)。由于聯(lián)合用藥有一定的風(fēng)險(xiǎn),我們考察了HAPKNPs/(Dex+siRNA)的安全性,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,HAPKNPs/(Dex+siRNA)作用24 h后,3T3、C2C12和PC12這3種正常細(xì)胞的存活率均在90%以上,且給藥后大鼠臟器的病理切片與正常大鼠并沒有顯著變化,以上結(jié)果表明HAPKNPs/(Dex+siRNA)具有很高的安全性。綜上,本文構(gòu)建的透明質(zhì)酸修飾酸敏感共傳遞納米載體能夠有效的將藥物遞送至RA發(fā)病部位并發(fā)揮作用,同時(shí)MCL-1 siRNA與Dex的聯(lián)合用藥能夠更好的抑制RA的進(jìn)程。這為以后RA的靶向治療和藥物聯(lián)合治療提供了一種新思路。
【圖文】：

圖 2.2 Dex 全波長掃描Figure 2.2 The UV spectrum of Dex.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Dex 的濃度對(duì)應(yīng)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2.3，其中回歸方程為 y = 37699503，，R2= 1。結(jié)果表明在濃度為 0 μg/mL-320 μg/mL 的范圍內(nèi)濃度與峰面積關(guān)系良好。

圖 2.2 Dex 全波長掃描Figure 2.2 The UV spectrum of Dex2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Dex 的濃度對(duì)應(yīng)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 2.3，其中回歸方程為 y = 37699x +21503，R2= 1。結(jié)果表明在濃度為 0 μg/mL-320 μg/mL 的范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R593.22;R943

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