【摘要】：癌癥是21世紀(jì)人類健康面臨的巨大挑戰(zhàn)之一,近幾十年針對(duì)癌癥的治療方法層出不窮,其中抗體藥物作為里程碑式的治療手段在癌癥的治療中發(fā)揮著巨大的作用,至今已有80多種藥物被FDA批準(zhǔn)上市。雖然抗體藥物在腫瘤的治療中占據(jù)著舉足輕重的地位,但是隨著臨床研究的深入,傳統(tǒng)的抗體藥物在腫瘤治療中的一些限制性逐漸暴露出來(lái)。主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:(1)傳統(tǒng)的抗體藥物主要為IgG型抗體,分子量約為150 kDa,較大的分子形式導(dǎo)致抗體具有進(jìn)入腫瘤部位量少、難以進(jìn)入腫瘤深處以及在腫瘤部位分布不均一等缺點(diǎn),從而導(dǎo)致藥效不佳或腫瘤易于復(fù)發(fā);(2)抗體藥物較長(zhǎng)的半衰期會(huì)增加潛在的脫靶毒性,造成較窄的治療窗;(3)目前上市以及處于臨床研究的抗體藥物主要針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen,TAA),這類抗原在腫瘤組織高表達(dá),但是也會(huì)低表達(dá)于一些正常組織,這就會(huì)造成“on targetoff tumor”脫靶效應(yīng),因此尋找腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen,TSA)顯得尤為重要。TSA由腫瘤突變(包括插入缺失、點(diǎn)突變以及基因融合等)產(chǎn)生,多數(shù)位于細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)蛋白可被降解成多膚從而被主要組織相容性復(fù)合物I(MHC I)遞呈到腫瘤表面形成多肽-組織相容性復(fù)合物(Peptide/MHC I complex,pMHC)。這類pMHC能特異性的區(qū)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞,但是一般情況下表達(dá)量很低。傳統(tǒng)抗體藥物(單克隆抗體和抗體偶聯(lián)藥物)抗腫瘤活性的發(fā)揮對(duì)抗原的數(shù)量有著一定要求(3000),抗原數(shù)目較少會(huì)導(dǎo)致抗體藥物藥效不佳,所以靶向pMHC的傳統(tǒng)抗體藥物研發(fā)難度較大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及基因工程技術(shù)的推動(dòng),抗體藥物的形式已經(jīng)不局限于傳統(tǒng)的IgG型,出現(xiàn)了各種形式的小型化抗體。為了提高小型化抗體的抗腫瘤活性,小型化抗體不斷往功能化抗體(抗體偶聯(lián)藥物和雙特異性抗體)的方向拓展。因此,本研究從抗體的小型化及功能化角度,對(duì)上述提到的抗體藥物存在的問(wèn)題展開(kāi)研究。首先,我們對(duì)Ofatumumab(OFA)進(jìn)行小型化改造。我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了四種以抗原結(jié)合片段(Fab)為基礎(chǔ)的小型化抗體Fab,2F(ab),Fab-CH2mut以及Fab-CH3mut。通過(guò)對(duì)小型化抗體進(jìn)行初步評(píng)價(jià)最終選擇Fab和Fab-CH3mut進(jìn)行后續(xù)研究。我們利用Sortase A酶促定點(diǎn)偶聯(lián)的方法制備了 Fab-vcMMAE(DAR～1),Fab-CH3mut-vcMMAE(DAR～1)以及OFA-vcMMAE(DAR～1.1)三種抗體偶聯(lián)物并對(duì)三種抗體偶聯(lián)物進(jìn)行了綜合的體內(nèi)外評(píng)價(jià)。首先Fab-vcMMAE和Fab-CH3mut-vcMMAE均保留了部分OFA-vcMMAE的親和力和內(nèi)吞效率。Fab-vcMMAE(IC50 2.92 nM)與OFA-vcMMAE(IC50 1.31 nM)體外活性相當(dāng)且明顯高于Fab-CH3mut-vcMMAE(IC50 16.87 nM)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,雖然Fab-vcMMAE的給藥劑量是OFA-vcMMAE的兩倍,且Fab-vcMMAE(4/6裸鼠腫瘤消失)抗腫瘤活性略差于OFA-vcMMAE(6/6)。但是Fab-vcMMAE展現(xiàn)出較高的最大耐受劑量的優(yōu)勢(shì),其有望在適當(dāng)?shù)慕o藥劑量下達(dá)到與OFA-vcMMAE相同的抗腫瘤效果。體內(nèi)生物分布結(jié)果顯示Fab-vcMMAE與OFA-vcMMAE相比具有較快的腫瘤穿透速率以及相當(dāng)?shù)哪[瘤部位聚集量。Fab-CH3mut-vcMMAE與Fab-vcMMAE相比,雖然藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)得到顯著的改善但是由于抗體在腫瘤部位較低的聚集量導(dǎo)致抗腫瘤效果不佳,這可能與改造后Fab-CH3mut的單體的抗體形式有關(guān)。我們的研究結(jié)果證明了抗體片段偶聯(lián)物在腫瘤治療中的潛力,而且是一種有效解決傳統(tǒng)抗體藥物由于較大的分子形式在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的限制性問(wèn)題,同時(shí)也為后續(xù)的小型化抗體的改造提供了指導(dǎo)。部分小型化的抗體偶聯(lián)物由于較差的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì),導(dǎo)致抗腫瘤效果不理想。為了提高其抗腫瘤活性,一方面可以通過(guò)蛋白融合改善藥動(dòng)學(xué)性質(zhì),一方面可以通過(guò)偶聯(lián)活性更強(qiáng)的毒性分子。目前使用的活性較強(qiáng)的毒性分子如海兔毒素類、美登素類等IC50一般在pM級(jí)別,但更高毒性的分子難以獲得。人體的免疫細(xì)胞在腫瘤治療中有巨大的潛力,可以嘗試將靶向T細(xì)胞的OKT3抗體與靶向腫瘤細(xì)胞的抗體偶聯(lián),從而得到T細(xì)胞依賴的雙特異性抗體。雙特異性抗體的抗腫瘤活性一般是ADC的100～1000倍,且其活性的發(fā)揮不依賴于抗體的內(nèi)吞作用,所以可以將由于內(nèi)吞性質(zhì)較差(如OFA)或者不內(nèi)吞造成抗腫瘤活性不理想的抗體開(kāi)發(fā)成雙特異性抗體。我們采用酶促-化學(xué)偶聯(lián)的方法將OKT3抗體的Fab片段與Fab-CD20抗體片段進(jìn)行偶聯(lián),從而得到雙特異性抗體2F(ab,)-CD20-CD3。我們選擇的酶促-化學(xué)偶聯(lián)的方法不僅拓展了雙特異性抗體的制備方法,而且與傳統(tǒng)的制備方法相比能夠確保異源二聚體的正確組裝,有較高的偶聯(lián)效率和易于分離純化的優(yōu)點(diǎn)。我們研究發(fā)現(xiàn)2F(ab')-CD20-CD3抗體在與腫瘤細(xì)胞共孵育的條件下,能夠特異性的激活T細(xì)胞,引起T細(xì)胞的增殖,并發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性的殺傷作用。體外活性結(jié)果顯示2F(ab,)-CD20-CD3對(duì)Ramos和Daudi細(xì)胞的EC50分別為2.75 pM和2.62 pM。動(dòng)物模型中,在1mg/kg的給藥濃度下能顯著的抑制腫瘤生長(zhǎng),其抗腫瘤活性顯著高于Fab-vcMMAE。2F(ab')-CD20(OFA)-CD3與目前文獻(xiàn)報(bào)道的IgG形式的針對(duì)CD20的雙特異性抗體(利妥昔)的體內(nèi)外活性水平相當(dāng)。此外缺乏抗體恒定區(qū)Fc的2F(ab')-CD20-CD3抗體不僅具有較快的組織穿透性而且可以避免由于Fc的非特異性結(jié)合造成的毒副作用。雖然靶向CD20的小型化雙特異性抗體展示了極高的活性,但是由于CD20也表達(dá)于正常的B細(xì)胞,故難以避免對(duì)正常細(xì)胞造成損傷從而造成毒副作用。為了進(jìn)一步從安全性方面優(yōu)化小型化抗體,我們選擇腫瘤新生抗原-突變遞呈肽/主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)作為研究對(duì)象。這類pMHC抗原具有較高的特異性,但是由于較低的抗原表達(dá)水平導(dǎo)致傳統(tǒng)的單克隆抗體或者ADC治療效果不佳。對(duì)于T細(xì)胞而言,只需要10～100個(gè)抗原的刺激便能有效的激活并招募T細(xì)胞特異性的殺傷細(xì)胞表面抗原表達(dá)量較低的腫瘤細(xì)胞,因此雙特異性抗體是針對(duì)特異性高但遞呈量少的新生抗原中抗體藥物靶向治療的一個(gè)有效的補(bǔ)充。我們以KRAS G12V/HLA-A02-01作為研究靶點(diǎn),利用酶促-化學(xué)偶聯(lián)的方法制備了針對(duì)該靶點(diǎn)的2F(ab')-2Gl-CD3抗體,初步的評(píng)價(jià)了雙特性異性抗體的質(zhì)量以及體外生物活性。2F(ab')-2G1-CD3在體外對(duì)的抗原遞呈量很少(300)的SW480(KARS G12V/HLA0201)細(xì)胞有明顯的殺傷作用(EC50～31.5 nM),而對(duì) A375(KRAS Wildf/HLA0201),K562-A2(KARS Wild/HLA0201)和 K562-A3(KARS Wild/HLA0301)沒(méi)有殺傷作用,說(shuō)明靶向腫瘤特異性pMHC的雙特異性抗體的在保持良好活性同時(shí)提高了特異性。IgG形式的2G1×CD3在1 mg/kg給藥濃度下顯著的抑制小鼠移植瘤的生長(zhǎng),預(yù)示了 2F(ab')-2G1-CD3在體內(nèi)具有較好的抗腫瘤活性。我們的研究為靶向低表達(dá)、高特異的腫瘤新生抗原的藥物研發(fā)提供新方案。本研究從抗體藥物的實(shí)際缺陷出發(fā),在小型化抗體的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)抗體片段進(jìn)行功能化修飾,得到了活性強(qiáng)、安全性高的多種小型化抗體藥物。我們的研究結(jié)果證明小型化抗體偶聯(lián)藥物及小型化雙特異性抗體是解決傳統(tǒng)抗體藥物由于較大的分子形式、靶點(diǎn)特性及抗原數(shù)目在治療中展現(xiàn)的限制性的有效形式。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R91

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本文編號(hào)：2686556