【摘要】：第一部分黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺對金黃色葡萄球菌生物被膜干預(yù)作用的體外研究目的:檢測受試的金黃色葡萄球菌菌株能否形成生物被膜,構(gòu)建穩(wěn)定的體外生物被膜模型。探討黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺對體外構(gòu)建的金黃色葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用。方法:廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供的由臨床分離獲得的MRSA 17546(t037型)為實驗菌株,采用剛果紅平板法定性該菌株能否形成生物被膜,同時采用硅膠膜作為建模載體,LB肉湯作為培養(yǎng)基,構(gòu)建體外生物被膜模型,分別運(yùn)用銀染法及掃描電鏡觀察體外構(gòu)建的金黃色葡萄球菌生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用二倍稀釋法測定黃芩苷、利奈唑胺對MRSA 17546的MIC。在體外構(gòu)建3天及7天的金黃色葡萄球菌生物被膜模型,在第3天及第7天加入藥物干預(yù)24小時,實驗分組如下:空白組、黃芩苷組、利奈唑胺組、黃芩苷+利奈唑胺組。采用連續(xù)稀釋法進(jìn)行菌落計數(shù),結(jié)晶紫半定量測定生物被膜量,掃描電鏡觀察生物被膜的形態(tài)。結(jié)果:在剛果紅平板上生長的金黃色葡萄球菌菌落變黑,菌落外周的剛果紅培養(yǎng)基顏色消退,可定性受檢測的MRSA 17546為能形成生物被膜的陽性菌株。在24孔板里,LB肉湯作為培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)3天,采用銀染法處理,在光學(xué)顯微鏡下可見磨玻璃狀、云絮狀的生物被膜,透光欠佳。連續(xù)培養(yǎng)7天,銀染法處理后光學(xué)顯微下可見更加致密的團(tuán)塊狀、云霧狀的生物被膜,透光度明顯減低。掃描電鏡觀察到在硅膠膜表面,連續(xù)培養(yǎng)3天,形成早期的生物被膜,可見粘稠的細(xì)胞外基質(zhì),生物被膜內(nèi)可見散在的金黃色葡萄球菌;連續(xù)培養(yǎng)7天,形成成熟的生物被膜,細(xì)胞外基質(zhì)更多更粘稠,其中見較多的金黃色葡萄球菌。黃芩苷、利奈唑胺對MRSA 17546的MIC值分別為2048μg/mL、2μg/mL。連續(xù)稀釋活菌計數(shù)及結(jié)晶紫半定量測定生物被膜量結(jié)果顯示:無論是早期(3天)還是成熟(7天)的生物被膜,黃芩苷單獨干預(yù)組及利奈唑胺單獨干預(yù)組與空白對照組比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但是黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺治療組與空白對照組、黃芩苷組、利奈唑胺組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。掃描電鏡顯示黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺組的載體表面生物被膜的細(xì)胞外基質(zhì)及生物被膜內(nèi)的金黃色葡萄球菌明顯減少。結(jié)論:1、臨床菌株MRSA 17546能形成金黃色葡萄球菌生物被膜。2、以硅膠膜為載體,LB肉湯為培養(yǎng)基,MRSA 17546能在體外形成穩(wěn)定的金黃色葡萄球菌生物被膜。3、黃芩苷可破壞金黃色葡萄球菌生物被膜,可協(xié)同利奈唑胺進(jìn)入生物被膜內(nèi)殺滅其中的金黃色葡萄球菌。第二部分構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物被膜的動物體內(nèi)模型目的:探討構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物被膜動物體內(nèi)模型,為后續(xù)藥物干預(yù)體內(nèi)實驗提供基礎(chǔ)。方法:以臨床分離獲得的MRSA 17546為實驗菌株,分別建立大鼠背部皮下羧甲基纖維素鈉空氣囊袋感染模型及硅膠膜植入大鼠背部的感染模型。在建模后不同時間點分別采用連續(xù)稀釋活菌計數(shù)法定量分析生物被膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量及掃描電鏡法觀察生物被膜的形態(tài)。結(jié)果:連續(xù)活菌計數(shù)表明:羧甲基纖維素鈉空氣囊袋感染模型的生物被膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量變化較大,硅膠膜植入模型構(gòu)建的生物被膜膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量隨著時間延長處于相對穩(wěn)定。掃描電鏡觀察顯示:羧甲基纖維素鈉囊袋模型觀察到的較多粘稠樣物質(zhì),而且難以與細(xì)菌生物被膜區(qū)分開。硅膠膜植入模型載體表面可看見較典型的金黃色葡萄球菌生物被膜。結(jié)論:羧甲基纖維素鈉空氣囊袋感染模型及硅膠膜植入大鼠背部的感染模型均可成功模擬構(gòu)建金黃色葡萄球菌生物被膜的動物感染模型。后一種模型更為簡便、穩(wěn)定。因此后續(xù)的藥物干預(yù)作用采用該模型。第三部分黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺對金黃色葡萄球菌生物被膜干預(yù)作用的體內(nèi)研究目的:探討黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺對體內(nèi)構(gòu)建的金黃色葡萄球菌生物被膜的干預(yù)作用。方法:以廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離獲得的MRSA 17546為實驗菌株,建立硅膠膜植入大鼠背部感染模型。建模當(dāng)天立即給與藥物干預(yù),分為空白組、黃芩苷組、利奈唑胺組、黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺組。在建模后第1、2、3天采用連續(xù)稀釋活菌計數(shù)法進(jìn)行定量分析,采用掃描電鏡觀察細(xì)菌生物被膜形態(tài),直接肉眼觀察背部局部組織炎癥反應(yīng)表現(xiàn),硅膠膜周圍組織用HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,腹腔采血后行炎癥因子PCT、CRP含量檢測。結(jié)果:連續(xù)稀釋活菌計數(shù)結(jié)果表明:給與藥物干預(yù)1天后,黃芩苷組、利奈唑胺組生物被膜內(nèi)細(xì)菌載量與空白組比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺組與其它組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。藥物干預(yù)2天后,黃芩苷組與空白組比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。利奈唑胺組與空白組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺組與利奈唑胺組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。藥物干預(yù)3天后,各組生物被膜量較前均有減少,黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺組與空白組及各單藥組單獨比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示:藥物干預(yù)作用1天后,空白組、黃芩苷組、利奈唑胺組載體表面可見較多的粘稠樣物質(zhì)及細(xì)菌,彼此所見大致相同。而黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺明顯可以減少粘稠樣生物被膜形成,膜內(nèi)細(xì)菌明顯減少。藥物作用干預(yù)2、3天后,黃芩苷組載體表面生物被膜量與空白組相比仍沒有減少,利奈唑胺組載體表面粘稠樣物質(zhì)及細(xì)菌比空白組、黃芩苷組有所減少,聯(lián)合藥物干預(yù)組載體表面看到的生物被膜及細(xì)菌明顯減少。肉眼觀察植入載體周圍組織結(jié)果顯示,給與藥物干預(yù)后,利奈唑胺可減輕植入物周圍組織充血、滲出、水腫等炎癥反應(yīng)。黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺更能進(jìn)一步減輕植入物周圍組織的急性炎癥反應(yīng),到第3天觀察到植入物周圍組織幾乎無充血、滲出。組織活檢HE染色觀察到聯(lián)合用藥組鏡下可見的炎癥細(xì)胞明顯減少,隨著時間推移,可見較多泡沫樣細(xì)胞及成纖維組織。腹腔采血測定炎癥因子結(jié)果表明,聯(lián)合藥物干預(yù)組能明顯減輕全身炎癥反應(yīng),CRP、PCT含量與單藥組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:黃芩苷聯(lián)合利奈唑胺能明顯破壞并減少大鼠體內(nèi)金黃色葡萄球菌生物被膜,可有效減輕生物被膜相關(guān)感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

黃色葡萄球菌生物被膜干預(yù)作用的體內(nèi)外研究 結(jié) 果板法鑒定金黃色葡萄球菌形成細(xì)菌生物被膜附素(PIA)是金黃色葡萄球菌形成生物被膜的黑色，表明該菌株為能形成生物被膜陽性菌17546 在剛果紅瓊脂平板上生長的菌落變黑，，葡萄球菌生物被膜形成陽性菌株，如圖 1-1。

圖 1-2 銀染法觀察體外生物被膜(400×)bservation of biofilm in vitro by silver staining method ( magn鏡法：醫(yī)用硅膠模在 24 孔板培養(yǎng) 3 天，掃面被膜三維立體結(jié)構(gòu)，在粘稠樣胞外基質(zhì)中
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R965

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本文編號：2686234