【摘要】：目的:BHX是一種新型吡唑啉衍生物,通過阻止Wnt/β-catenin信號通路而對多種腫瘤發(fā)揮出強效抗腫瘤作用。然而,其對乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用及相關(guān)機制尚不明確。本課題擬從以下兩方面進行研究:1.體外體內(nèi)研究BHX對乳腺癌的增殖抑制作用。2.深入研究BHX抑制乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移的可能作用機制。方法:1.檢測BHX體內(nèi)外對乳腺癌的增殖及轉(zhuǎn)移的抑制作用;體外實驗研究中,選取乳腺癌細胞系三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231作為研究對象,利用MTT法、二維克隆形成實驗、Transwell侵襲實驗、劃痕實驗進行研究;體內(nèi)實驗研究中,在裸鼠腋下通過皮下注射方式接種MDA-MB-231細胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,將裸鼠移植瘤小鼠隨機分為四組,空白對照組、BHX低劑量給藥組、BHX中劑量給藥組、BHX高劑量給藥組,腹腔注射給藥,并且在裸鼠腋下通過皮下注射方式接種熒光素酶基因標記的MDA-MB-231細胞,建立裸鼠移植瘤模型,將裸鼠移植瘤小鼠隨機分為空白對照組、BHX中劑量組,在給藥前后分別進行小動物活體成像實驗,通過研究裸鼠體內(nèi)乳腺癌腫瘤體積抑制狀況來探索BHX的體內(nèi)藥效。2.為了進一步研究BHX抑制人惡性乳腺癌增殖及轉(zhuǎn)移的作用機制,我們研究了BHX對三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞周期、細胞凋亡、細胞內(nèi)ROS、WNT通路相關(guān)蛋白β-catenin以及與EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin、SNAIL和Vimentin及其基因轉(zhuǎn)錄情況。首先我們利用流式細胞儀技術(shù)檢測了BHX對MDA-MB-231細胞系細胞周期及細胞凋亡的影響,然后檢測了BHX對細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量的影響,最后通過Western blot技術(shù)檢測BHX對Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin以及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、SNAIL和Vimentin的調(diào)控作用,并通過PCR技術(shù)檢測SNAIL、Vimentin、β-catenin、E-cadherin的m RNA表達水平。結(jié)果:1.MTT實驗結(jié)果表明BHX對MDA-MB-231細胞系增殖具有較好的抑制作用,且對正常乳腺上皮細胞細胞系MCF-10A的抑制作用較小;二維克隆形成實驗結(jié)果證明BHX可以抑制乳腺癌細胞的克隆形成能力,并且具有明顯量效關(guān)系;Transwell、劃痕實驗結(jié)果證明BHX可抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力;裸鼠皮下移植瘤實驗及活體成像實驗結(jié)果證明BHX在體內(nèi)可以抑制移植瘤的生長,具有良好的抗腫瘤作用;2.流式細胞儀檢測結(jié)果表明BHX可以使MDA-MB-231細胞系細胞周期發(fā)生阻滯,使其停滯在G0/G1期,使細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量增加,還可以誘導細胞產(chǎn)生早期凋亡,且具有明顯的量效關(guān)系;Western blot實驗結(jié)果表明BHX可以使β-catenin、SNAIL、Vimentin表達量下降,使E-cadherin表達量升高;PCR實驗證明BHX可以使SNAIL、Vimentin、β-catenin的m RNA表達量減少,使E-cadherin的m RNA表達量增加。結(jié)論:1.BHX具有較好的體內(nèi)體外抗乳腺癌作用,且對正常人體細胞抑制作用較小。2.BHX通過抑制Wnt通路活性以及逆轉(zhuǎn)EMT進程而發(fā)揮抑制乳腺癌增殖及轉(zhuǎn)移的作用。
【圖文】：

圖 I BHX 降低 β-連環(huán)蛋白/T 細胞因子轉(zhuǎn)錄活性作用顯著（利用測定細胞內(nèi) β-連環(huán)蛋白介導的轉(zhuǎn)錄活性的方法進行基因篩選，對 20 種先導化對 Wnt 通路信號的活性進行檢測。1 號為 DMSO 對照組，9 號為 BHX。）2）BHX 的反應路線和工藝流程HX 反應路線和工藝流程簡單、結(jié)構(gòu)圖譜分析明確，其合成量可以滿足課題需要。下面是 BHX 的反應路線及工藝流程。

圖 1 BHX 對細胞的增值抑制作用，橫坐標為藥物濃度（umol/L），縱坐標為抑制率（%）。A: BHX 作用于人正常乳腺上皮細胞 MCF-10A 和乳腺癌 MDA-MB-231 細胞 72 h 后的細胞抑制率；（#p＜0.05，##p＜0.01 vs control）B: BHX 對乳腺癌 MDA-MB-231 細胞作用 24、48、72 h 后的細胞抑制率情況；C: BHX 作用于乳腺癌 MDA-MB-231 細胞 24 h 后在 200 倍光學顯微鏡下觀察到的細胞形態(tài)學的變化1.3.1.2 BHX 對于乳腺癌細胞 MDA-MB-231 細胞克隆形成的作用為證明 BHX 對乳腺癌細胞 MDA-MB-231 細胞克隆形成的影響，我們利用二維克隆形成實驗的方法，研究 BHX 對于細胞 MDA-MB-231 細胞克隆形成的影響。如圖 2 所示，結(jié)果顯示，BHX 對 MDA-MB-231 克隆形成具有較明顯抑制作用，，在顯微鏡下可以觀察到藥物可以影響腫瘤細胞相互聚集，使其分散不形成克隆體。隨著藥物濃度增加，細胞形成克隆數(shù)量百分比逐漸降低，說明藥物對克隆形成的抑制率具有較明顯的時間和濃度依賴性，以上結(jié)果表明，BHX 對腫瘤細胞克隆形成具有抑制作用。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R965

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本文編號：2685132