【摘要】：背景:G蛋白偶聯(lián)苦味受體(Bitter taste receptors,TAS2Rs)是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)超家族的一員。TAS2Rs的早期研究主要集中在味覺(jué)系統(tǒng)。然而,近年來(lái)有關(guān)TAS2Rs在呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)逐漸引起人們的關(guān)注。研究表明,TAS2Rs在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá),且TAS2Rs激動(dòng)劑,苯甲地那銨、氯喹和奎寧可以舒張苯腎上腺素預(yù)收縮的豚鼠主動(dòng)脈。然而,目前有關(guān)TAS2Rs在大鼠主動(dòng)脈表達(dá)水平的研究未有文獻(xiàn)報(bào)道,且其調(diào)控大鼠主動(dòng)脈血管的作用及機(jī)制尚不明確。目的:明確TAS2Rs在大鼠主動(dòng)脈組織及分離的血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平,利用三種TAS2Rs激動(dòng)劑,苯甲地那銨、氯喹和奎寧,研究TAS2Rs對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管的調(diào)控作用,闡明其調(diào)控血管功能的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TAS2Rs在大鼠主動(dòng)脈組織和主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)水平。2.利用離體組織浴槽實(shí)驗(yàn),采用60 mM KCl、10μM苯腎上腺素和電刺激(10 V,25 Hz)三種條件預(yù)收縮大鼠主動(dòng)脈血管環(huán),研究?jī)煞NTAS2Rs激動(dòng)劑,苯甲地那銨和氯喹對(duì)三種條件預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的作用;研究奎寧對(duì)10μM苯腎上腺素和電刺激(10 V,25 Hz)兩種條件預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的作用;進(jìn)一步研究三種TAS2Rs激動(dòng)劑調(diào)控血管的作用是否依賴于內(nèi)皮細(xì)胞。3.利用離體組織浴槽實(shí)驗(yàn),使用L型鈣離子通道抑制劑nifedipine、非選擇性鉀離子通道抑制劑tetraethylammonium(TEA)、PLC抑制劑U-73221以及肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵抑制劑thapsigargin,研究TAS2Rs調(diào)控大鼠主動(dòng)脈的作用機(jī)制。結(jié)果:1.qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在大鼠主動(dòng)脈組織以及分離的血管平滑肌細(xì)胞中有6個(gè)TAS2Rs亞型表達(dá)。在主動(dòng)脈血管組織中TAS2R143、TAS2R135、TAS2R126、TAS2R120、TAS2R121和TAS2R108相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)水平分別為0.30±0.16%、0.19±0.08%、0.16±0.08%、0.07±0.04%、0.04±0.05%和0.07±0.03%;在分離的血管平滑肌細(xì)胞中,TAS2R143、TAS2R135、TAS2R126、TAS2R120、TAS2R121和TAS2R108相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)水平分別為2.01±0.71%、1.22±0.90%、0.20±0.08%、0.19±0.08%、0.10±0.03%和0.03±0.02%。2.在60 mM KCl預(yù)收縮大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的條件下,苯甲地那銨(50-1000μM)和氯喹(10-300μM)均可舒張預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán),且該舒張作用具有濃度依賴性;其中,當(dāng)苯甲地那銨和氯喹濃度分別為1000μM和300μM時(shí),兩者的舒張作用分別可達(dá)94.9±5.5%(P0.05)和87.2±3.9%(P0.05)。3.在苯腎上腺素預(yù)收縮大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的條件下,20μM苯甲地那銨可使主動(dòng)脈血管瞬時(shí)舒張(P0.05),隨后收縮,收縮作用可達(dá)43.4±22.1%(P0.05),苯甲地那銨(800-1500μM)可舒張大鼠主動(dòng)脈血管環(huán),且該舒張作用具有濃度依賴性,1500μM苯甲地那銨的舒張作用可達(dá)96.0±4.9%(P0.05);氯喹(20-300μM)及奎寧(100-200μM)對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)也具有舒張作用,且該舒張作用具有濃度依賴性,當(dāng)氯喹和奎寧濃度分別達(dá)到300μM和200μM時(shí),兩者對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用為100.5±3.7%(P0.05)和98.1±2.6%(P0.05)。4.在電刺激(10 V,25 Hz)預(yù)收縮大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的條件下,300μM和500μM苯甲地那銨對(duì)主動(dòng)脈血管的舒張的作用分別為81.1±7.0%和89.1±5.5%(P0.05);氯喹(50-200μM)呈濃度依賴性地舒張預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)(P0.05),且200μM氯喹舒張作用可達(dá)88.1±1.8%;200μM奎寧的舒張作用可達(dá)85.9±3.0%(P0.05)。5.當(dāng)去除大鼠主動(dòng)脈血管的內(nèi)皮細(xì)胞后,氯喹(20-300μM)和奎寧(100-200μM)對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用較內(nèi)皮完整組無(wú)顯著差異(P0.05),表明氯喹和奎寧對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用不依賴內(nèi)皮細(xì)胞;苯甲地那銨(20-500μM)對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)舒張作用強(qiáng)于內(nèi)皮完整組(P0.05)。6.TAS2Rs舒張預(yù)收縮的大鼠主動(dòng)脈的機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在苯腎上腺素預(yù)收縮的條件下,TEA可以減弱氯喹的舒張作用和苯甲地那銨的瞬時(shí)舒張作用:200μM氯喹的舒張作用從96.4±3.9%降低為71.9±10.7%(P0.05),20μM苯甲地那銨瞬時(shí)舒張作用消失(P0.05);Thapsigargin也可以減弱氯喹對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用:300μM氯喹的舒張作用從100.5±3.7%降低為50.2±7.4%(P0.05);在Ca~(2+)通道抑制劑nifedipine存在的情況下,20μM苯甲地那銨引起血管收縮的反應(yīng)消失(P0.05),奎寧的舒張作用減弱(P0.05)。結(jié)論:TAS2Rs在大鼠主動(dòng)脈血管和分離的血管平滑肌細(xì)胞中有表達(dá),TAS2Rs激動(dòng)劑可能是通過(guò)激活大鼠主動(dòng)脈血管中TAS2Rs而介導(dǎo)舒張血管的作用。三種TAS2Rs激動(dòng)劑的作用機(jī)制有所不同:氯喹可能是通過(guò)激活TAS2Rs,從而激活鉀離子通道和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子重吸收回肌質(zhì)網(wǎng)而發(fā)揮舒張作用;奎寧可能是通過(guò)激活TAS2Rs,抑制L型鈣離子通道從而降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度而引起血管舒張;苯甲地那銨可能是通過(guò)激活TAS2Rs,激活鉀離子通道而發(fā)揮瞬時(shí)舒張作用,激活L型鈣離子通道,從而增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度而引起血管收縮。
【圖文】：

圖 3-1 TAS2Rs在大鼠主動(dòng)脈血管和 VSMC中表達(dá)。大鼠主動(dòng)脈血管和 VSM 相對(duì)于內(nèi)參基因 GAPDH 的表達(dá)水平（Mean ±SEM; n = 6, N = 6; *P < 0.05 Aorta）。3-1 The mRNA expression level of TAS2Rs in rat aorta and VSMC. Relative eRs genes to the reference gene GAPDH in rat aorta and VSMC (Mean ±SEM; n =*P < 0.05, VSMC vs. Aorta).論于 TAS2Rs 在大鼠組織器官中表達(dá)水平的研究?jī)H有幾篇文獻(xiàn)報(bào)道。乏特異性 TAS2Rs 的抗體，，研究多集中在其 mRNA 表達(dá)水平的在大鼠腦細(xì)胞中檢測(cè)到了 TAS2R4、 TAS2R107 和 TAS2R38 mR近期，F(xiàn)oster 等在大鼠心臟中檢測(cè)到 TAS2R108、TAS2R120、TA126、TAS2R135、TAS2R137 和 TAS2R143 等 7 種 TAS2Rs mRN于 TAS2Rs 在大鼠主動(dòng)脈血管表達(dá)水平的研究未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此大鼠心臟中表達(dá)的 TAS2Rs 是否在大鼠主動(dòng)脈血管中同樣具有表達(dá)

4-1 苯甲地那銨舒張 60 mM KCl 預(yù)收縮的主動(dòng)脈血管環(huán)。（A）苯甲地那銨降低Cl 預(yù)收縮的主動(dòng)脈血管環(huán)張力的原始實(shí)驗(yàn)記錄圖。（B）苯甲地那銨對(duì) 60 mM KC主動(dòng)脈血管環(huán)舒張作用的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖（Mean ±SEM; n = 6, N = 6; *P < 0.05, Denatontrol）。igure 4-1 The relaxation effect of denatonium on aorta ring pre-contracted with 60 ) An original recording showing that denatonium decreased the tension of aorta ntracted with 60 mM KCl. (B) Summary data of the relaxation effect of denatonium on e-contracted with 60 mM KCl (Mean ±SEM; n = 6, N = 6; *P < 0.05, Denatonium vs. C② 氯喹對(duì) 60 mM KCl 預(yù)收縮的主動(dòng)脈血管環(huán)的作用氯喹可濃度依賴性地舒張 60 mM KCl 預(yù)收縮的主動(dòng)脈血管環(huán)（P ＜ 000 μM 氯喹可降低 87.2 ± 3.9% 的血管張力。氯喹（500 - 1000 μM）對(duì)預(yù)環(huán)張力降低的作用有所減弱。1000 μM 氯喹不能降低血管張力（P ＞圖 4-2）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2684608