【摘要】：目的1.探討OP16與雷帕霉素在體外聯(lián)用時,對食管鱗癌細胞增殖、凋亡、自噬的影響及其分子機制。2.探討OP16與雷帕霉素在體內(nèi)聯(lián)用時,對食管鱗癌裸鼠移植瘤生長、凋亡的影響及其分子機制,同時對藥物的潛在毒性進行初步評價。方法1.通過克隆形成實驗、CCK-8法檢測食管鱗癌細胞中OP16與雷帕霉素聯(lián)用時的抗增殖活性,同時通過Western blot檢測m TORC2/Akt(Ser473)和PI3K/Akt(Thr308)通路相關蛋白的表達。2.通過Annexin V-FITC/PI染色法檢測食管鱗癌細胞中OP16單用或與雷帕霉素聯(lián)用時的促凋亡活性,同時通過Western blot檢測線粒體凋亡通路相關蛋白的表達。3.通過Western blot、免疫熒光法檢測OP16對食管鱗癌細胞中LC3和SQSTM1/p62表達和分布的影響,接著通過Western blot、m RFP-GFP-LC3腺病毒實驗、透射電子顯微鏡檢測OP16對食管鱗癌細胞中自噬過程的影響,然后通過PI染色法、CCK-8法探討OP16誘導的自噬和凋亡之間的關系,最后通過Western blot探討OP16誘導自噬的分子機制。4.通過建立食管鱗癌裸鼠移植瘤模型,檢測OP16與雷帕霉素聯(lián)用時對腫瘤生長的抑制作用,通過HE染色法、TUNEL法檢測對細胞體內(nèi)凋亡的誘導作用,通過Western blot檢測裸鼠移植瘤中m TORC2/Akt(Ser473)、PI3K/Akt(Thr308)及線粒體凋亡通路相關蛋白的表達,并通過對裸鼠死亡率、體重變化、血常規(guī)參數(shù)、臟器系數(shù)及肝腎HE染色的檢測對藥物潛在毒性進行初步評價。結果1.食管鱗癌細胞中,OP16與雷帕霉素聯(lián)用可協(xié)同抑制克隆形成;OP16與RAD001聯(lián)用可協(xié)同抑制細胞增殖;OP16單用能抑制p-Akt、PI3K p85α、PI3K p110α的表達,并促進p-Rictor的表達;OP16與雷帕霉素聯(lián)用可抑制雷帕霉素引起的p-Akt、PI3K p85α、PI3K p110α表達升高,并逆轉(zhuǎn)雷帕霉素引起的p-Rictor表達降低。2.食管鱗癌細胞中,OP16單用可促進細胞凋亡;OP16與雷帕霉素聯(lián)用可協(xié)同促進細胞凋亡;OP16單用能抑制Bcl-2的表達,并促進Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達;OP16與雷帕霉素聯(lián)用時可協(xié)同抑制Bcl-2的表達,并協(xié)同促進Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達。3.食管鱗癌細胞中,OP16可以促進LC3的表達和胞內(nèi)聚集,并抑制SQSTM1/p62的表達;OP16可促進自噬體形成從而激活自噬流;通過Z-VAD-FMK抑制凋亡不能減少OP16引起的細胞死亡;通過饑餓處理激活自噬能顯著增加OP16引起的細胞死亡;通過Chloroquine處理或下調(diào)Beclin-1表達抑制自噬,均能顯著減少OP16引起的細胞死亡;OP16不影響Atg5、Atg7和Atg12的表達;通過SC79升高Akt磷酸化能顯著降低OP16誘導的LC3-II表達。4.食管鱗癌裸鼠移植瘤模型中,OP16與雷帕霉素聯(lián)用可協(xié)同抑制腫瘤生長,并協(xié)同誘導細胞的體內(nèi)凋亡;OP16與雷帕霉素聯(lián)用對裸鼠移植瘤中相關蛋白表達的影響與體外結果一致;OP16與雷帕霉素聯(lián)用對裸鼠的死亡率、體重變化、血常規(guī)參數(shù)、臟器系數(shù)均無明顯影響,且沒有明顯的肝腎毒性出現(xiàn)。結論1.OP16與雷帕霉素在體外聯(lián)用時可協(xié)同調(diào)控食管鱗癌細胞的增殖、凋亡、自噬,其分子機制與OP16和雷帕霉素對m TORC2/Akt(Ser473)、PI3K/Akt(Thr308)和線粒體凋亡通路的調(diào)控作用有關。2.OP16與雷帕霉素在體內(nèi)聯(lián)用時可協(xié)同調(diào)控食管鱗癌裸鼠移植瘤的生長和凋亡,其分子機制與體外實驗一致。在治療劑量下兩藥聯(lián)用時,裸鼠體內(nèi)無明顯不良反應或藥物毒性反應出現(xiàn)。
【圖文】：

喉腫痛、扁桃腺炎等癥，且其對多種腫瘤均有一定療效，尤其是對消化道腫效果可與紫杉醇相較[20]。近年來更有臨床研究證明，冬凌草單用或與化療藥用可顯著增加食管癌患者生存率，展現(xiàn)出了較好的治療效果[19,21]。在眾多抗中藥中，冬凌草具有良好抗腫瘤活性和低毒性的特點，且其作為一種野生植我國的資源非常豐富，逐漸引起了眾多醫(yī)藥研究者的關注[22-23]。冬凌草中的化學成分主要包括二萜、三萜、甾體、黃酮、生物堿以及氨基化合物[24-25]，其中二萜類化合物冬凌草甲素（oridonin）是其主要的抗腫瘤分子之一[26-27]。已有大量機制研究證明，冬凌草甲素能靶向腫瘤細胞的增期、凋亡和自噬等通路，因而具有一定的抗腫瘤活性[28-30]。然而由于冬凌草水溶性較差、抗腫瘤活性較一線藥物相對較弱、化學結構不穩(wěn)定等原因，限其在臨床上的應用[31-32]。因此，，當下的研究重點應立足于從冬凌草中提取新性分子，并對其結構進行修飾改造以改善其抗腫瘤活性和化學結構穩(wěn)定性，對其藥理作用機制進行深入研究，從而開發(fā)出來源于冬凌草的高效抗腫瘤，改善癌癥患者特別是食管癌患者的治療現(xiàn)狀。

5圖 1.2 p70S6K 介導的負反饋通路由于上述原因，越來越多的研究者認為在使用 mTORC1 抑制劑的同時抑制PI3K 或者 mTORC2 的活性能有效抑制 mTORC1 抑制劑引起的 Akt 負反饋激活可能具有更為理想的腫瘤抑制作用[37,59,68-69,77]，因而推動了 PI3K/mTOR 雙重抑制劑和 mTORC1/mTORC2 雙重抑制劑的產(chǎn)生[82]。然而后續(xù)的臨床前和臨床研究中發(fā)現(xiàn)，mTORC1/mTORC2 雙重抑制劑依然不能有效的削弱 Akt 的負反饋激活效應[83]；而 PI3K/mTOR 雙重抑制劑對該通路具有徹底抑制作用，因而在臨床應用中具有很大的藥物毒性，治療窗較窄[59,83]。這些原因?qū)е铝嗽搩煞N新型 mTO抑制劑的臨床應用極大受限，負反饋通路這一問題依然沒有得到有效解決。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R96

【參考文獻】

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1 楊帥;雷帕霉素和OP16對食管鱗癌細胞增殖及Akt/PTEN表達的影響[D];鄭州大學;2014年

本文編號：2683921