【摘要】：目的:通過暴露納米氧化鋁建立斑馬魚幼魚早期神經(jīng)行為損傷模型,探討m TOR信號(hào)分子在其中所起的作用及可能機(jī)制。方法:將受精后6h(6hpf)的斑馬魚胚胎隨機(jī)分成6組,染毒6天:空白對(duì)照組(E3培養(yǎng)液)、納米氧化鋁組(12.5、25、50、100、200μg/m L)。采用六孔板染毒,每組160顆卵,共8個(gè)孔,20顆卵/10m L試液/孔,染毒液更新周期為1天。染毒結(jié)束后,通過斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)檢測(cè)各組幼魚的早期神經(jīng)行為,包括黑暗狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)行為及趨觸性檢測(cè)、對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反射試驗(yàn);采用ICP-MS檢測(cè)各組幼魚腦部的鋁含量。采用RT-PCR法檢測(cè)各組幼魚腦部m TOR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá);采用全組織包埋免疫組化法檢測(cè)各組幼魚腦部m TOR蛋白的表達(dá);采用顯微注射法特異性敲低m TOR基因的表達(dá),觀察斑馬魚幼魚早期神經(jīng)行為的改變。結(jié)果:1.斑馬魚幼魚行為學(xué)結(jié)果:與溶劑對(duì)照組相比,25μg/m L納米氧化鋁組幼魚的運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)距離均顯著上升(P0.05),之后隨染毒濃度的增加,又出現(xiàn)下降的趨勢(shì);200μg/m L納米氧化鋁組幼魚趨觸性程度較溶劑對(duì)照組顯著下降(P0.05);100μg/m L和200μg/m L納米氧化鋁組對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐反射和強(qiáng)光刺激后的黑暗逃避反射能力均下降(P0.05)。2.幼魚腦部鋁含量檢測(cè)結(jié)果:納米氧化鋁組染毒24h后的胚胎和染毒48h后的幼魚腦部深染,以100μg/m L組最為明顯;與溶劑對(duì)照組相比,100μg/m L納米氧化鋁組幼魚腦部的鋁含量顯著增加(P0.05)。3.RT-PCR結(jié)果:50、100和200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部m TOR的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P0.05);25、50μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部AKT3的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P0.05)。PIK3Ca、PIK3R1、AKT1、AKT2、AMPK、TSC1、TSC2基因的表達(dá)量各組間均無明顯差異(P0.05)。50、100和200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部ULK1的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P0.05);100、200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部ULK2的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P0.05);200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部Beclin1的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P0.05)。Cyt C、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ基因的表達(dá)量各組間均無明顯差異(P0.05)。4.全組織包埋免疫組化結(jié)果:與溶劑對(duì)照組相比,50、100、200μg/m L納米氧化鋁組幼魚腦部熒光信號(hào)降低,提示m TOR蛋白表達(dá)下調(diào)。5.顯微注射結(jié)果:顯微注射m TOR Morpholino組幼魚的運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)距離與對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而顯微注射組幼魚的趨觸性程度與對(duì)照組相比顯著下降(P0.05);與對(duì)照組相比,顯微注射組幼魚對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐反射能力下降(P0.05);且幼魚腦部m TOR基因的表達(dá)降低(P0.05)。結(jié)論:1.納米氧化鋁主要抑制了幼魚早期的趨觸性行為和對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反射,對(duì)運(yùn)動(dòng)行為表現(xiàn)為低劑量興奮、高劑量抑制的效應(yīng)。2.納米氧化鋁可在斑馬魚幼魚腦部蓄積,且蓄積量隨著染毒濃度的增加而增加。3.納米氧化鋁可下調(diào)幼魚腦部m TOR蛋白和基因的表達(dá),同時(shí)使自噬相關(guān)基因ULK1、ULK2、Beclin1表達(dá)量增加。4.特異性敲減m TOR基因可抑制斑馬魚幼魚早期的神經(jīng)行為。
【圖文】：

一次卵裂；受精后 2.5~3h 為囊胚初期，此時(shí)可以開始染毒實(shí)驗(yàn)（ 已發(fā)育成一條未破膜的幼魚，身體時(shí)而卷曲（見圖 C）；受精出，此時(shí)的幼魚身體色素沉著較少，，通體透明，腦組織清晰可見受精后 6 天的幼魚已初具成魚的形態(tài)，腦組織進(jìn)一步發(fā)育（見幼魚就可以開始喂食。胚胎從受精卵發(fā)育至受精后 6 天的幼魚重要階段[21]，在此階段對(duì)幼魚的染毒處理影響因素單一、數(shù)量足實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，是神經(jīng)行為發(fā)育研究的良好模型。為是各項(xiàng)神經(jīng)功能的整合[22]，包括運(yùn)動(dòng)能力、神經(jīng)反射、感覺能統(tǒng)的發(fā)育是其物質(zhì)基礎(chǔ)。斑馬魚幼魚在早期階段就可以表現(xiàn)出暗狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)行為、趨觸性行為和對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反出的幼魚就具有運(yùn)動(dòng)行為，主要檢測(cè)指標(biāo)為運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)距魚開始表現(xiàn)出趨觸性行為和對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反射，趨觸緊張程度有關(guān)，而對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反射是幼魚先天具有的

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文周期控制在 14h/l0h。以卵凝結(jié)或心臟停跳為死亡終點(diǎn)，記錄受精后 ；分別記錄胚胎受精后 48、54、60、72、96h 的孵化率。黑暗狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)行為及趨觸性檢測(cè): 在顯微鏡下隨機(jī)選擇各濃度組外pf（day post-fertilization）幼魚，將其放入 24 孔板中，24 條/組。開啟為軌跡跟蹤系統(tǒng)，參考文獻(xiàn)[27]設(shè)置觀察區(qū)域和檢測(cè)程序。將每個(gè)觀察區(qū)等的兩個(gè)區(qū)：內(nèi)區(qū)（inner area）和外區(qū)（outer area），如圖 2 示。采動(dòng)視頻。用 EthoVision XT 10 軟件分析視頻，導(dǎo)出運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)距計(jì)持續(xù)時(shí)間百分?jǐn)?shù)等參數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R99

【參考文獻(xiàn)】

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3 郭衛(wèi)偉;常麗俊;丁勇;李歡;葛翠翠;王海洋;張勤麗;牛僑;;納米氧化鋁亞慢性染毒致小鼠神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷機(jī)制[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2014年02期

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本文編號(hào)：2683786