發(fā)布時間：2020-05-27 16:06

【摘要】：目的:通過暴露納米氧化鋁建立斑馬魚幼魚早期神經(jīng)行為損傷模型,探討m TOR信號分子在其中所起的作用及可能機制。方法:將受精后6h(6hpf)的斑馬魚胚胎隨機分成6組,染毒6天:空白對照組(E3培養(yǎng)液)、納米氧化鋁組(12.5、25、50、100、200μg/m L)。采用六孔板染毒,每組160顆卵,共8個孔,20顆卵/10m L試液/孔,染毒液更新周期為1天。染毒結束后,通過斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)檢測各組幼魚的早期神經(jīng)行為,包括黑暗狀態(tài)下的運動行為及趨觸性檢測、對強光刺激的驚恐逃避反射試驗;采用ICP-MS檢測各組幼魚腦部的鋁含量。采用RT-PCR法檢測各組幼魚腦部m TOR信號通路相關基因的表達;采用全組織包埋免疫組化法檢測各組幼魚腦部m TOR蛋白的表達;采用顯微注射法特異性敲低m TOR基因的表達,觀察斑馬魚幼魚早期神經(jīng)行為的改變。結果:1.斑馬魚幼魚行為學結果:與溶劑對照組相比,25μg/m L納米氧化鋁組幼魚的運動速度、運動距離均顯著上升(P0.05),之后隨染毒濃度的增加,又出現(xiàn)下降的趨勢;200μg/m L納米氧化鋁組幼魚趨觸性程度較溶劑對照組顯著下降(P0.05);100μg/m L和200μg/m L納米氧化鋁組對強光刺激的驚恐反射和強光刺激后的黑暗逃避反射能力均下降(P0.05)。2.幼魚腦部鋁含量檢測結果:納米氧化鋁組染毒24h后的胚胎和染毒48h后的幼魚腦部深染,以100μg/m L組最為明顯;與溶劑對照組相比,100μg/m L納米氧化鋁組幼魚腦部的鋁含量顯著增加(P0.05)。3.RT-PCR結果:50、100和200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部m TOR的表達量明顯低于對照組(P0.05);25、50μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部AKT3的表達量明顯低于對照組(P0.05)。PIK3Ca、PIK3R1、AKT1、AKT2、AMPK、TSC1、TSC2基因的表達量各組間均無明顯差異(P0.05)。50、100和200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部ULK1的表達量明顯高于對照組(P0.05);100、200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部ULK2的表達量明顯高于對照組(P0.05);200μg/m L納米氧化鋁組斑馬魚幼魚腦部Beclin1的表達量明顯高于對照組(P0.05)。Cyt C、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ基因的表達量各組間均無明顯差異(P0.05)。4.全組織包埋免疫組化結果:與溶劑對照組相比,50、100、200μg/m L納米氧化鋁組幼魚腦部熒光信號降低,提示m TOR蛋白表達下調(diào)。5.顯微注射結果:顯微注射m TOR Morpholino組幼魚的運動速度和運動距離與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);而顯微注射組幼魚的趨觸性程度與對照組相比顯著下降(P0.05);與對照組相比,顯微注射組幼魚對強光刺激的驚恐反射能力下降(P0.05);且幼魚腦部m TOR基因的表達降低(P0.05)。結論:1.納米氧化鋁主要抑制了幼魚早期的趨觸性行為和對強光刺激的驚恐逃避反射,對運動行為表現(xiàn)為低劑量興奮、高劑量抑制的效應。2.納米氧化鋁可在斑馬魚幼魚腦部蓄積,且蓄積量隨著染毒濃度的增加而增加。3.納米氧化鋁可下調(diào)幼魚腦部m TOR蛋白和基因的表達,同時使自噬相關基因ULK1、ULK2、Beclin1表達量增加。4.特異性敲減m TOR基因可抑制斑馬魚幼魚早期的神經(jīng)行為。
【圖文】：

一次卵裂；受精后 2.5~3h 為囊胚初期，此時可以開始染毒實驗（ 已發(fā)育成一條未破膜的幼魚，身體時而卷曲（見圖 C）；受精出，此時的幼魚身體色素沉著較少，，通體透明，腦組織清晰可見受精后 6 天的幼魚已初具成魚的形態(tài)，腦組織進一步發(fā)育（見幼魚就可以開始喂食。胚胎從受精卵發(fā)育至受精后 6 天的幼魚重要階段[21]，在此階段對幼魚的染毒處理影響因素單一、數(shù)量足實驗結果穩(wěn)定，是神經(jīng)行為發(fā)育研究的良好模型。為是各項神經(jīng)功能的整合[22]，包括運動能力、神經(jīng)反射、感覺能統(tǒng)的發(fā)育是其物質(zhì)基礎。斑馬魚幼魚在早期階段就可以表現(xiàn)出暗狀態(tài)下的運動行為、趨觸性行為和對強光刺激的驚恐逃避反出的幼魚就具有運動行為，主要檢測指標為運動速度和運動距魚開始表現(xiàn)出趨觸性行為和對強光刺激的驚恐逃避反射，趨觸緊張程度有關，而對強光刺激的驚恐逃避反射是幼魚先天具有的

山西醫(yī)科大學碩士學位論文周期控制在 14h/l0h。以卵凝結或心臟停跳為死亡終點，記錄受精后 ；分別記錄胚胎受精后 48、54、60、72、96h 的孵化率。黑暗狀態(tài)下的運動行為及趨觸性檢測: 在顯微鏡下隨機選擇各濃度組外pf（day post-fertilization）幼魚，將其放入 24 孔板中，24 條/組。開啟為軌跡跟蹤系統(tǒng)，參考文獻[27]設置觀察區(qū)域和檢測程序。將每個觀察區(qū)等的兩個區(qū)：內(nèi)區(qū)（inner area）和外區(qū)（outer area），如圖 2 示。采動視頻。用 EthoVision XT 10 軟件分析視頻，導出運動速度、運動距計持續(xù)時間百分數(shù)等參數(shù)。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R99

【參考文獻】

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3 郭衛(wèi)偉;常麗俊;丁勇;李歡;葛翠翠;王海洋;張勤麗;牛僑;;納米氧化鋁亞慢性染毒致小鼠神經(jīng)細胞線粒體損傷機制[J];中國藥理學與毒理學雜志;2014年02期

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本文編號：2683786