【摘要】：淋巴瘤是一類起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,是淋巴組織內原有的淋巴細胞或組織細胞發(fā)生惡性增生的結果,淋巴瘤約占全球腫瘤的3-4%。隨著多年來對其機制的研究,現在認為淋巴瘤的發(fā)病原因多與人體的免疫系統(tǒng)相關,但其發(fā)病機制尚不明確。CRM1是細胞內重要的核轉運蛋白之一,其負責轉運的蛋白大約有285個,且這些貨物蛋白多與腫瘤的發(fā)生密切相關,如抑癌因子survivin、p53、p27κIP1、APC等。研究顯示CRM1的表達量與多種類型淋巴瘤的發(fā)生密切相關,且CRM1高表達的患者預后較差。天然產物為小分子藥物的發(fā)現提供了豐富的來源,其結構多樣性,化學性質多樣性,生物相容性等特征為藥物篩選提供了非常好的基礎。因此,從自然界中發(fā)現能夠靶向抑制CRM1的天然小分子,闡明其作用機制,并以此為基礎,對小分子進行優(yōu)化和設計,得到靶向性更強,毒副作用更低的CRM1抑制劑,能為CRM1高表達的淋巴瘤的治療提供新的治療方案。本論文主要針對以上問題做了如下幾個方面的研究。第一,CRM1蛋白可能為萊菔素(LFS-01)在體內發(fā)揮生物學功能的一個重要靶點。本研究首先通過細胞活性檢測的方法驗證了 LFS-01抑制淋巴瘤細胞增殖的作用,并且發(fā)現LFS-01對正常人外周血單核細胞PBMC的增殖基本無影響。通過靶點驗證試驗及MALDI-TOF質譜試驗驗證了 LFS-01能夠和CRM1發(fā)生共價結合,且結合位點為Cys528。通過激光共聚焦檢測方法,發(fā)現LFS-01能抑制CRM1介導的RanBP1和p53的細胞核輸出。通過構建CRM1突變細胞株,證明CRM1是LFS-01在細胞內的主要靶點之一。通過Western blot方法檢測,發(fā)現LFS-01能夠降低細胞內CRM1的蛋白水平。借助流式細胞術,檢測到LFS-01能夠將淋巴瘤細胞周期抑制在G2-M期,并且能夠激活內源性凋亡通路,誘導淋巴瘤細胞凋亡。第二,通過LDH實驗、電鏡檢測、Western blot及激光共聚焦等試驗手段,發(fā)現LFS-01能夠引起淋巴瘤細胞發(fā)生自噬。通過檢測線粒體和自噬小體及線粒體和溶酶體的共定位,發(fā)現LFS-01誘導的自噬屬于線粒體自噬。進一步研究發(fā)現,LFS-01誘導線粒體自噬發(fā)生的兩個主要因素分別為AMPK-mTOR通路的激活和p62蛋白表達量的上調。其中,p62表達量上調的主要原因是CRM1被抑制后Nrf2的細胞核輸出受阻,從而增加p62基因的轉錄。通過建立小鼠模型,發(fā)現LFS-01能夠通過誘導細胞凋亡和細胞自噬來抑制小鼠體內腫瘤細胞的生長。第三,通過計算機輔助的藥物設計,借助Discovery Studio工具,以CRM1和LFS-01的結合構象為基礎,進行了基于受體結構的藥物生長,得到一系列能夠靶向CRM1的小分子。通過虛擬篩選結合經驗分析,合成了4個代表性小分子。通過抗腫瘤活性檢測,發(fā)現LFS-25的活性最好。與LFS-01相比,LFS-25的活性提高了 50倍。通過分子動力學模擬和MM-PBSA能量分解分析,發(fā)現LFS-25靶向性增強的原因可能是與NES 口袋中的氨基酸殘基有更強的范德華力△Evdw和靜電相互作用△Eele。通過對內源性貨物蛋白RanBP1和p53的出核抑制檢測及對外源性NES-GFP蛋白和Foxo1-GFP蛋白的出核抑制檢測,證實了 LFS-25對CRM1的靶向抑制活性。并且發(fā)現Cys528是LFS-25靶向作用于CRM1的重要氨基酸。在彌漫性大B細胞淋巴瘤中,通過激光共聚焦和Western blot手段,觀察到IκBα在細胞核內的聚集。通過免疫共沉淀技術,檢測到隨著藥物濃度的增加,滯留在細胞核內的IκBα和NF-κB的相互作用增強。通過雙熒光素酶報告基因檢測技術,觀察到NF-κB的轉錄活性被LFS-25抑制。最后,通過流式細胞術發(fā)現LFS-25能夠將細胞周期抑制在G1期,同時激活細胞凋亡信號通路,誘導細胞發(fā)生凋亡。本論文通過多種實驗檢測手段闡明了萊菔素靶向作用CRM1和抑制淋巴瘤細胞增殖的作用機制,并以萊菔素為先導化合物,設計了具有更強靶向性和抗淋巴瘤作用的小分子藥物LFS-25,并且對LFS-25殺傷大B細胞淋巴瘤的機制做了初步探討。
【圖文】：

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【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914;R96

【參考文獻】

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本文編號：2683684