【摘要】：淋巴瘤是一類起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,是淋巴組織內(nèi)原有的淋巴細(xì)胞或組織細(xì)胞發(fā)生惡性增生的結(jié)果,淋巴瘤約占全球腫瘤的3-4%。隨著多年來(lái)對(duì)其機(jī)制的研究,現(xiàn)在認(rèn)為淋巴瘤的發(fā)病原因多與人體的免疫系統(tǒng)相關(guān),但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。CRM1是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一,其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白大約有285個(gè),且這些貨物蛋白多與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),如抑癌因子survivin、p53、p27κIP1、APC等。研究顯示CRM1的表達(dá)量與多種類型淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān),且CRM1高表達(dá)的患者預(yù)后較差。天然產(chǎn)物為小分子藥物的發(fā)現(xiàn)提供了豐富的來(lái)源,其結(jié)構(gòu)多樣性,化學(xué)性質(zhì)多樣性,生物相容性等特征為藥物篩選提供了非常好的基礎(chǔ)。因此,從自然界中發(fā)現(xiàn)能夠靶向抑制CRM1的天然小分子,闡明其作用機(jī)制,并以此為基礎(chǔ),對(duì)小分子進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)計(jì),得到靶向性更強(qiáng),毒副作用更低的CRM1抑制劑,能為CRM1高表達(dá)的淋巴瘤的治療提供新的治療方案。本論文主要針對(duì)以上問(wèn)題做了如下幾個(gè)方面的研究。第一,CRM1蛋白可能為萊菔素(LFS-01)在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本研究首先通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)的方法驗(yàn)證了 LFS-01抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖的作用,并且發(fā)現(xiàn)LFS-01對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞PBMC的增殖基本無(wú)影響。通過(guò)靶點(diǎn)驗(yàn)證試驗(yàn)及MALDI-TOF質(zhì)譜試驗(yàn)驗(yàn)證了 LFS-01能夠和CRM1發(fā)生共價(jià)結(jié)合,且結(jié)合位點(diǎn)為Cys528。通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)方法,發(fā)現(xiàn)LFS-01能抑制CRM1介導(dǎo)的RanBP1和p53的細(xì)胞核輸出。通過(guò)構(gòu)建CRM1突變細(xì)胞株,證明CRM1是LFS-01在細(xì)胞內(nèi)的主要靶點(diǎn)之一。通過(guò)Western blot方法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LFS-01能夠降低細(xì)胞內(nèi)CRM1的蛋白水平。借助流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)到LFS-01能夠?qū)⒘馨土黾?xì)胞周期抑制在G2-M期,并且能夠激活內(nèi)源性凋亡通路,誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡。第二,通過(guò)LDH實(shí)驗(yàn)、電鏡檢測(cè)、Western blot及激光共聚焦等試驗(yàn)手段,發(fā)現(xiàn)LFS-01能夠引起淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。通過(guò)檢測(cè)線粒體和自噬小體及線粒體和溶酶體的共定位,發(fā)現(xiàn)LFS-01誘導(dǎo)的自噬屬于線粒體自噬。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),LFS-01誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生的兩個(gè)主要因素分別為AMPK-mTOR通路的激活和p62蛋白表達(dá)量的上調(diào)。其中,p62表達(dá)量上調(diào)的主要原因是CRM1被抑制后Nrf2的細(xì)胞核輸出受阻,從而增加p62基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)建立小鼠模型,發(fā)現(xiàn)LFS-01能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬來(lái)抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。第三,通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的藥物設(shè)計(jì),借助Discovery Studio工具,以CRM1和LFS-01的結(jié)合構(gòu)象為基礎(chǔ),進(jìn)行了基于受體結(jié)構(gòu)的藥物生長(zhǎng),得到一系列能夠靶向CRM1的小分子。通過(guò)虛擬篩選結(jié)合經(jīng)驗(yàn)分析,合成了4個(gè)代表性小分子。通過(guò)抗腫瘤活性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LFS-25的活性最好。與LFS-01相比,LFS-25的活性提高了 50倍。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬和MM-PBSA能量分解分析,發(fā)現(xiàn)LFS-25靶向性增強(qiáng)的原因可能是與NES 口袋中的氨基酸殘基有更強(qiáng)的范德華力△Evdw和靜電相互作用△Eele。通過(guò)對(duì)內(nèi)源性貨物蛋白R(shí)anBP1和p53的出核抑制檢測(cè)及對(duì)外源性NES-GFP蛋白和Foxo1-GFP蛋白的出核抑制檢測(cè),證實(shí)了 LFS-25對(duì)CRM1的靶向抑制活性。并且發(fā)現(xiàn)Cys528是LFS-25靶向作用于CRM1的重要氨基酸。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中,通過(guò)激光共聚焦和Western blot手段,觀察到IκBα在細(xì)胞核內(nèi)的聚集。通過(guò)免疫共沉淀技術(shù),檢測(cè)到隨著藥物濃度的增加,滯留在細(xì)胞核內(nèi)的IκBα和NF-κB的相互作用增強(qiáng)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù),觀察到NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性被LFS-25抑制。最后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)LFS-25能夠?qū)⒓?xì)胞周期抑制在G1期,同時(shí)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本論文通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段闡明了萊菔素靶向作用CRM1和抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,并以萊菔素為先導(dǎo)化合物,設(shè)計(jì)了具有更強(qiáng)靶向性和抗淋巴瘤作用的小分子藥物L(fēng)FS-25,并且對(duì)LFS-25殺傷大B細(xì)胞淋巴瘤的機(jī)制做了初步探討。
【圖文】：

Ｗｏｒｌｄ邋Ｈｅａｌｔｈ邋Ｏｉｇａｎｉｚａｌｂｎ邐ｅｎｃａｎｃｅｒ邋ａ0ｕ逡逑圖１．１淋巴瘤的流行病學(xué)研究（２０１２）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｌｙｍｐｈｏｍａ邋（２０１２）逡逑Ａ邋８００ｔ邐Ｉ邋＾ｔ１００邋Ｂ邋１２０了邐ｔ６逡逑＿邋Ｍａｌｅ邋ｃａｓｅｓ邐Ｉ邐－ｆ？ｏ邋ｃ邐Ｍａｌｅ邋ｃａｓｅｓ邋—Ｆｅｍａｌｅ邋ｃａｓｅｓ逡逑Ｆｅｍａｌｅ邋ｃａｓｅｓ邐］Ｊ邋，，８0｜邋１００．邋一＿yU—Ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｅｓ邋Ａ邋５邋｜逡逑ｉｚＭＣｌｉｉ逡逑圖１．２不同性別不同年齡段ＮＨＬ邋（Ａ）和ＨＬ邋（Ｂ）的發(fā)病率［１］逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｏｆ邋ｎｅｗ邋ｃａｓｅｓ邋ａｎｄ邋ａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ邋ｒａｔｅｓ邋ｉｎ邋ｍａｌｅ邋ａｎｄ邋ｆｅｍａｌｅ，逡逑ｆｏｒ邋（Ａ）邋ＮＨＬ邋ａｎｄ邋（Ｂ）邋ＨＬ逡逑（１）病毒及細(xì)菌感染逡逑很早之前人們就發(fā)現(xiàn)免疫缺陷綜合癥患者體內(nèi)的淋巴細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)增殖紊亂，因此早逡逑３逡逑

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【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R914;R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2683684