【摘要】：微核試驗(yàn)是應(yīng)用最廣泛的體內(nèi)遺傳毒性檢測(cè)方法,可用于多種靶器官的遺傳毒性檢測(cè)。其中肝微核試驗(yàn)方法是除造血系統(tǒng)微核試驗(yàn)以外研究較為深入的一種靶器官試驗(yàn)方法,因?yàn)榕c造血系統(tǒng)微核試驗(yàn)相比,肝微核試驗(yàn)可檢測(cè)出代謝產(chǎn)物為一過(guò)性致癌物的前體致癌物。同時(shí)肝臟作為人體內(nèi)最重要的代謝器官之一,多種遺傳毒物都會(huì)導(dǎo)致肝臟的遺傳毒性。因此在2014年第六屆國(guó)際遺傳毒理學(xué)的工作大會(huì)上,也有越來(lái)越多關(guān)于肝微核試驗(yàn)方法作為人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)S2(R1)第二種組合試驗(yàn)可在骨髓及外周血以外組織進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)的討論,同時(shí)在工作大會(huì)上也提出了肝微核試驗(yàn)的推薦試驗(yàn)規(guī)程。但是肝微核試驗(yàn)在進(jìn)入正式應(yīng)用之前,需要經(jīng)過(guò)大量驗(yàn)證。早在2004年,日本環(huán)境誘變劑/哺乳動(dòng)物致突變性研究組內(nèi)的微核試驗(yàn)方法的聯(lián)合研究組已牽頭開(kāi)展了對(duì)幼年大鼠肝微核試驗(yàn)方法的國(guó)際聯(lián)合驗(yàn)證,該方法的驗(yàn)證在2010年完成。對(duì)重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法的聯(lián)合驗(yàn)證則在2014年開(kāi)始,已有大部分?jǐn)?shù)據(jù)報(bào)道,為將來(lái)本試驗(yàn)指導(dǎo)原則的制定奠定了基礎(chǔ)。與國(guó)外多家試驗(yàn)室已經(jīng)完成肝微核試驗(yàn)的驗(yàn)證相比,國(guó)內(nèi)對(duì)該項(xiàng)試驗(yàn)的研究才剛剛起步。本課題旨在首先建立大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法,并驗(yàn)證該試驗(yàn)方法的可行性。同時(shí)ICH S2(R1)指導(dǎo)原則推薦將不同的遺傳毒性終點(diǎn)的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)合于同一實(shí)驗(yàn)中,并嘗試與一般毒性試驗(yàn)聯(lián)合,可大大提高試驗(yàn)效率,試驗(yàn)設(shè)計(jì)貼近3R原則,故本課題進(jìn)一步嘗試將肝微核試驗(yàn)方法與肝彗星試驗(yàn)、外周血微核試驗(yàn)及Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)聯(lián)合進(jìn)行體內(nèi)遺傳毒性檢測(cè),提高試驗(yàn)效率并盡量避免假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。本課題分為兩部分:第一部分是以重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)的國(guó)際聯(lián)合驗(yàn)證的方法為基礎(chǔ),采用驗(yàn)證中的肝微核陽(yáng)性化合物N-亞硝基二乙胺(DEN)進(jìn)行大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法的建立,初步驗(yàn)證該方法的靈敏度和重復(fù)性;同時(shí)將肝微核試驗(yàn)與肝彗星試驗(yàn)及外周血微核試驗(yàn)結(jié)合于同一實(shí)驗(yàn)中,聯(lián)合表征DEN的遺傳毒性信息,嘗試建立體內(nèi)遺傳毒性多終點(diǎn)試驗(yàn)方法。第二部分主要應(yīng)用不同機(jī)制的四種物質(zhì):金胺、鄰氨基偶氮甲苯、1,3-丙烷磺內(nèi)酯和氨基甲酸甲酯,并以DEN為陽(yáng)性對(duì)照物對(duì)大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證;在驗(yàn)證肝微核方法的同時(shí),結(jié)合肝彗星試驗(yàn)、外周血微核試驗(yàn)或Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)聯(lián)合檢測(cè)各個(gè)受試物的遺傳毒性,最大程度地表征受試物的遺傳毒性信息,進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)遺傳多終點(diǎn)試驗(yàn)的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。本研究所獲得的結(jié)果主要如下:1、在大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法的建立階段,應(yīng)用已知的遺傳毒性陽(yáng)性化合物DEN進(jìn)行方法的建立。經(jīng)過(guò)酶消化并固定后的肝細(xì)胞懸液,染色后在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)含微核的細(xì)胞數(shù)量,得到DEN的肝微核試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)際聯(lián)合驗(yàn)證中一致:DEN的中和高劑量組肝細(xì)胞中的微核率(%MNHEP)與陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加,且表現(xiàn)出劑量-反應(yīng)關(guān)系;DEN的肝彗星試驗(yàn)結(jié)果也與文獻(xiàn)中結(jié)果一致,與陰性對(duì)照組相比,DEN的低、中和高各劑量組平均DNA尾密度都出現(xiàn)了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加;在外周血微核試驗(yàn)中,DEN低、中及高劑量組中的網(wǎng)織紅細(xì)胞微核率(%MN-RET)與陰性對(duì)照組相比均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與文獻(xiàn)結(jié)果一致。因此本試驗(yàn)成功建立了大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法,并證明了肝微核試驗(yàn)、肝彗星試驗(yàn)和外周血微核試驗(yàn)聯(lián)合的體內(nèi)多終點(diǎn)試驗(yàn)方法的可行性和重復(fù)性。2、在大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法的驗(yàn)證階段,金胺的肝微核試驗(yàn)和肝彗星結(jié)果均為陽(yáng)性,外周血微核試驗(yàn)結(jié)果和Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果均呈陰性,這一物質(zhì)的結(jié)果提示了與外周血微核相比肝微核試驗(yàn)的必要性;鄰氨基偶氮甲苯的肝微核試驗(yàn)、肝彗星試驗(yàn)及Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果均為陰性,僅有外周血微核結(jié)果為陽(yáng)性;1,3-丙烷磺內(nèi)酯的肝微核試驗(yàn)、肝彗星試驗(yàn)和外周血微核試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性;氨基甲酸甲酯的肝微核試驗(yàn)、肝彗星試驗(yàn)與外周血微核試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性,故氨基甲酸甲酯判定為非遺傳毒性化合物。初步得到以下結(jié)論:1、DEN的肝微核試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性,與國(guó)際聯(lián)合驗(yàn)證中結(jié)果一致,因而本試驗(yàn)室初步建立了大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法,同時(shí)將肝微核試驗(yàn)、肝彗星試驗(yàn)與外周血微核試驗(yàn)結(jié)合共同評(píng)價(jià)了DEN的遺傳毒性,彗星試驗(yàn)與外周血微核試驗(yàn)的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致,初步建立了體內(nèi)遺傳毒性多終點(diǎn)檢測(cè)方法。2、采用四種不同機(jī)制的化合物對(duì)大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,肝微核試驗(yàn)結(jié)果大致符合預(yù)期,證明該方法有較高的靈敏度及重復(fù)性。3、同時(shí)進(jìn)行的肝微核試驗(yàn)、肝彗星試驗(yàn)、外周血微核試驗(yàn)及Pig-a基因突變?cè)囼?yàn),除鄰氨基偶氮甲苯的彗星試驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道結(jié)果不符,可能是由于低劑量多次暴露的試驗(yàn)方法對(duì)彗星試驗(yàn)結(jié)果有所影響;對(duì)金胺和鄰氨基偶氮甲苯兩個(gè)物質(zhì)進(jìn)行了Pig-a基因突變?cè)囼?yàn),結(jié)果均呈陰性,與金胺和鄰氨基偶氮甲苯的代謝活性產(chǎn)物在外周血暴露量都較少的事實(shí)相符;其他已知遺傳毒性終點(diǎn)結(jié)果皆與已有報(bào)道一致,證明了體內(nèi)遺傳毒性多終點(diǎn)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。綜上所述,(1)本研究成功建立了大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法;(2)選擇了不同機(jī)制的四個(gè)化合物進(jìn)一步驗(yàn)證了大鼠重復(fù)給藥肝微核試驗(yàn)方法;(3)同時(shí)建立了體內(nèi)多個(gè)終點(diǎn)遺傳毒性檢測(cè)方法,為今后肝微核試驗(yàn)與其他終點(diǎn)的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)或與一般毒理研究聯(lián)合應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
【圖文】：

mg/kg）大鼠肝微核圖像nucleus image of DEN (12.5 mg/kg) group像鏡 200 倍鏡頭下，，應(yīng)用 Comet Assay IV對(duì)照組和 EMS 陽(yáng)性對(duì)照組的肝彗星圖像

2-2 大鼠肝臟 comet 圖像，A：陰性對(duì)照組，B：陽(yáng)性對(duì)照組 2-2 Liver’s cell images, A:negative group, B:positive group.4 DEN 的肝微核和肝彗星試驗(yàn)結(jié)果在肝微核試驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比，DEN 中劑量和高劑量組肝臟微核率現(xiàn)顯著增加，且隨著 DEN 劑量的升高，肝臟微核率表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R965

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本文編號(hào)：2683574