【摘要】：目的:昆布多糖作為一種安全性高并具有多種生理活性的天然β-1,3-葡萄糖聚合物,被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本文通過以昆布多糖修飾獲得了一種粒徑較小、均一穩(wěn)定且具有良好抗肝癌活性的納米硒,并采用分子生物學手段對其抗肝癌機制進行了深入研究。方法:利用昆布多糖作為穩(wěn)定劑和修飾劑,以抗壞血酸還原亞硒酸鈉的方法制備得到昆布多糖修飾的納米硒(LP-SeNPs)。應(yīng)用透射電子顯微鏡(TEM)、激光粒度儀、紫外可見光譜、能量散射X射線光譜儀等儀器對合成的納米硒進行結(jié)構(gòu)表征。采用MTT法研究LP-SeNPs對HepG2肝癌細胞的增殖抑制作用,應(yīng)用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測LP-SeNPs對細胞凋亡的影響。Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Casepase 9及自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達水平。通過溶酶體活性和酸性的評估檢測LP-SeNPs對溶酶體功能的影響。結(jié)果:制備得到了粒徑大小為60 nm的昆布多糖納米硒,TEM測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),LP-SeNPs呈現(xiàn)單分散均勻的球形結(jié)構(gòu),MTT結(jié)果表明,LP-SeNPs對人肝癌HepG2細胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用。進一步的作用機制研究發(fā)現(xiàn),LP-SeNPs被肝癌細胞攝取后,首先定位于溶酶體,然后由溶酶體釋放入胞質(zhì)發(fā)揮作用。Western blot結(jié)果顯示,LP-SeNPs作用HepG2細胞12和24 h均顯著上調(diào)Bax和cleaved Casepase 9的表達,并下調(diào)Bcl-2的表達水平,表明LP-SeNPs可激活線粒體途徑凋亡。此外,孵育LP-SeNPs后能誘導(dǎo)LC3-II和p62蛋白的上調(diào),并能通過影響溶酶體的功能抑制自噬后期進程。結(jié)論:本文所制備的昆布多糖納米硒對人肝癌細胞具有顯著的生長抑制作用,其可能是通過抑制自噬和誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮對人肝癌細胞的抗腫瘤作用。本實驗為抗肝癌藥物的進一步研究提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

通過調(diào)節(jié)昆布多糖的濃度可控制所得硒納米粒子的粒徑大小。如圖2-1A 所示，當昆布多糖的濃度為 1 mg/mL（0.1%）時，所制備的硒納米顆粒粒徑最小，平均粒徑為 60 nm。所制備的 LP-SeNPs 溶液的照片和 Zeta 電位顯示在圖 2-1B中。溶液的顏色表明形成的硒納米顆粒是橙紅色的。LP-SeNPs 的 Zeta 電位值大于SeNPs 的值，且所制備的 LP-SeNPs 溶液在室溫下放置兩個月后無明顯聚集和沉淀，表明昆布多糖修飾后的 LP-SeNPs 與未修飾的 SeNPs 相比具有更好的穩(wěn)定性。TEM照片如圖 2-1C 所示，表明所制備的 LP-SeNPs 為均一球形單分散的顆粒，平均粒徑為 58 nm，與激光粒度儀的粒徑結(jié)果一致。元素分析的結(jié)果見圖 2-1D 中。分析結(jié)果顯示

1.5 和 2.5 h，用熒光酶標儀測定各孔的熒光強度。如圖2-2A 所示，熒光強度顯示時間和劑量依賴性，，提示細胞對 LP-SeNPs 的攝取以時間和劑量依賴的方式進行。納米材料主要通過內(nèi)吞作用進入細胞[22]。Lyso Tracker Red 是一種熒光染料，用于溶酶體的熒光成像，以檢測 LP-SeNPs 在 HepG2 細胞中的位置。如圖 2-2B 所示，綠色和紅色熒光的重合清楚地表明 LP-SeNP 和溶酶體在 HepG2 細胞中的共定位。這些結(jié)果表明溶酶體是 LP-SeNPs 的主要靶器官，定位于溶酶體中的 LP-SeNPs 以時間依賴性方式增加。圖 2-2 昆布多糖納米硒的體外攝取與細胞內(nèi)定位A.HepG2 細胞對香豆素-6 負載的 LP-SeNPs 的攝取分析；B.香豆素-6 負載的昆布多糖納米硒的細胞內(nèi)定位。標尺為 20 μm。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R96

【參考文獻】

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本文編號：2682136