【摘要】：目的:昆布多糖作為一種安全性高并具有多種生理活性的天然β-1,3-葡萄糖聚合物,被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本文通過以昆布多糖修飾獲得了一種粒徑較小、均一穩(wěn)定且具有良好抗肝癌活性的納米硒,并采用分子生物學(xué)手段對(duì)其抗肝癌機(jī)制進(jìn)行了深入研究。方法:利用昆布多糖作為穩(wěn)定劑和修飾劑,以抗壞血酸還原亞硒酸鈉的方法制備得到昆布多糖修飾的納米硒(LP-SeNPs)。應(yīng)用透射電子顯微鏡(TEM)、激光粒度儀、紫外可見光譜、能量散射X射線光譜儀等儀器對(duì)合成的納米硒進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。采用MTT法研究LP-SeNPs對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用,應(yīng)用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)LP-SeNPs對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Casepase 9及自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達(dá)水平。通過溶酶體活性和酸性的評(píng)估檢測(cè)LP-SeNPs對(duì)溶酶體功能的影響。結(jié)果:制備得到了粒徑大小為60 nm的昆布多糖納米硒,TEM測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),LP-SeNPs呈現(xiàn)單分散均勻的球形結(jié)構(gòu),MTT結(jié)果表明,LP-SeNPs對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用。進(jìn)一步的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),LP-SeNPs被肝癌細(xì)胞攝取后,首先定位于溶酶體,然后由溶酶體釋放入胞質(zhì)發(fā)揮作用。Western blot結(jié)果顯示,LP-SeNPs作用HepG2細(xì)胞12和24 h均顯著上調(diào)Bax和cleaved Casepase 9的表達(dá),并下調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平,表明LP-SeNPs可激活線粒體途徑凋亡。此外,孵育LP-SeNPs后能誘導(dǎo)LC3-II和p62蛋白的上調(diào),并能通過影響溶酶體的功能抑制自噬后期進(jìn)程。結(jié)論:本文所制備的昆布多糖納米硒對(duì)人肝癌細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用,其可能是通過抑制自噬和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)人肝癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)為抗肝癌藥物的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

通過調(diào)節(jié)昆布多糖的濃度可控制所得硒納米粒子的粒徑大小。如圖2-1A 所示，當(dāng)昆布多糖的濃度為 1 mg/mL（0.1%）時(shí)，所制備的硒納米顆粒粒徑最小，平均粒徑為 60 nm。所制備的 LP-SeNPs 溶液的照片和 Zeta 電位顯示在圖 2-1B中。溶液的顏色表明形成的硒納米顆粒是橙紅色的。LP-SeNPs 的 Zeta 電位值大于SeNPs 的值，且所制備的 LP-SeNPs 溶液在室溫下放置兩個(gè)月后無(wú)明顯聚集和沉淀，表明昆布多糖修飾后的 LP-SeNPs 與未修飾的 SeNPs 相比具有更好的穩(wěn)定性。TEM照片如圖 2-1C 所示，表明所制備的 LP-SeNPs 為均一球形單分散的顆粒，平均粒徑為 58 nm，與激光粒度儀的粒徑結(jié)果一致。元素分析的結(jié)果見圖 2-1D 中。分析結(jié)果顯示

1.5 和 2.5 h，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度。如圖2-2A 所示，熒光強(qiáng)度顯示時(shí)間和劑量依賴性，，提示細(xì)胞對(duì) LP-SeNPs 的攝取以時(shí)間和劑量依賴的方式進(jìn)行。納米材料主要通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[22]。Lyso Tracker Red 是一種熒光染料，用于溶酶體的熒光成像，以檢測(cè) LP-SeNPs 在 HepG2 細(xì)胞中的位置。如圖 2-2B 所示，綠色和紅色熒光的重合清楚地表明 LP-SeNP 和溶酶體在 HepG2 細(xì)胞中的共定位。這些結(jié)果表明溶酶體是 LP-SeNPs 的主要靶器官，定位于溶酶體中的 LP-SeNPs 以時(shí)間依賴性方式增加。圖 2-2 昆布多糖納米硒的體外攝取與細(xì)胞內(nèi)定位A.HepG2 細(xì)胞對(duì)香豆素-6 負(fù)載的 LP-SeNPs 的攝取分析；B.香豆素-6 負(fù)載的昆布多糖納米硒的細(xì)胞內(nèi)定位。標(biāo)尺為 20 μm。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943;R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2682136