【摘要】：云芝糖肽(PSP)是從云芝發(fā)酵菌絲體中提取的結(jié)合蛋白多糖,臨床上用于增強(qiáng)腫瘤病人的免疫功能。近年發(fā)現(xiàn)它還能直接通過(guò)干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制抑制、殺傷多種癌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)PSP誘導(dǎo)Molt-4等白血病細(xì)胞死亡過(guò)程中形態(tài)除發(fā)生典型凋亡樣固縮改變外,還有體積膨大現(xiàn)象,提示可能有其它死亡機(jī)制存在,因此本研究進(jìn)一步進(jìn)行了探討。研究用顯微測(cè)量術(shù)測(cè)量了PSP引起的Molt-4細(xì)胞直徑變化。結(jié)果顯示,20、40、80μg/mL PSP可分別使細(xì)胞平均直徑從正常的10.80±1.40μm增加到12.12±2.06、13.01±2.63和13.81±2.52μm(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)前散射信號(hào)分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大小有增加和縮小兩種不同的變化。細(xì)胞與PSP(20、40、80μg/mL)分別孵育48h后用caspase-1熒光抑制劑FLICA標(biāo)記,再用流式細(xì)胞術(shù)分析FLICA陽(yáng)性細(xì)胞比率,發(fā)現(xiàn)由對(duì)照組的2.38%分別增加到4.57、5.25、16.40%(P0.05)。用PSP作用12、24、36、48h后再同樣檢測(cè),發(fā)現(xiàn)FLICA陽(yáng)性細(xì)胞比率從對(duì)照組的3.2%分別增加到8.65、12.4、18.6和22.8%(P0.001)。這些結(jié)果提示PSP可濃度和時(shí)間依賴性激活Molt-4細(xì)胞中的caspase-1。VX-765、Ac-YVAD-CMK等caspase-1抑制劑在25-100μM濃度范圍內(nèi)不但不能抑制PSP誘導(dǎo)的caspase-1激活及細(xì)胞死亡,還顯示出明顯的細(xì)胞毒性。采用流式細(xì)胞分析法,用Gating技術(shù)分析FLICA陽(yáng)性細(xì)胞(FLICA+)在前散射(FS)/側(cè)散射(SS)信號(hào)散點(diǎn)圖上的分布,發(fā)現(xiàn)FS信號(hào)強(qiáng)(體積較大)的細(xì)胞百分率隨PSP(80μg/mL)作用時(shí)間延長(zhǎng),由對(duì)照組的4.71%分別增加到29.8%(12h)、34.7%(24h)、46.2%(36h)、30.0%(P0.01)(48h)。FS信號(hào)弱的較小的細(xì)胞百分率雖然也有增加(9.51、13.3、17.1、24.4%,P0.001),但顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)空泡,有FLICA標(biāo)記的胞質(zhì)邊緣化推斷由此變化造成FS信號(hào)減弱,而非體積變化所致。細(xì)胞用FLICA、7-AAD和Annexin V-APC三種試劑同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記,流式細(xì)胞檢測(cè),Gating選取7-AAD陰性的完整細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨PSP濃度和作用時(shí)間的增加,細(xì)胞出現(xiàn)Annexin V陽(yáng)性、FLICA陰性(Ann+/FLICA-)的細(xì)胞和FLICA陽(yáng)性、Annexin V陰性(Ann-/FLICA+)的細(xì)胞及Ann+/FLICA+的細(xì)胞三種不同變化,提示有部分細(xì)胞(Ann+/FLICA-)發(fā)生早期凋亡,部分細(xì)胞發(fā)生caspase-1相關(guān)的死亡(Ann-/FLICA+),且這種死亡機(jī)制與凋亡有關(guān)(Ann+/FLICA+)。時(shí)序研究發(fā)現(xiàn)Ann-/FLICA+的細(xì)胞先出現(xiàn)在前,Ann+/FLICA+的細(xì)胞出現(xiàn)在后,提示caspase-1相關(guān)的細(xì)胞死亡機(jī)制可轉(zhuǎn)為凋亡。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Ann-/FLICA+的細(xì)胞FS信號(hào)強(qiáng),細(xì)胞具有較大的體積,而Ann+/FLICA+的細(xì)胞FS信號(hào)弱,也提示細(xì)胞體積增大和caspase-1激活是細(xì)胞死亡過(guò)程中早期的事件。caspase-1參與的細(xì)胞死亡過(guò)程通常伴隨IL-1β和IL-18的產(chǎn)生,因此用實(shí)時(shí)定量PCR方法分析了PSP誘導(dǎo)的Molt-4中IL-1β和IL-18基因表達(dá)水平。以GADPH基因?yàn)閮?nèi)參,發(fā)現(xiàn)20,40,80μg/mL PSP可濃度及時(shí)間依賴地上調(diào)IL-1β和IL-18基因表達(dá)。IL-1β最高被上調(diào)2.9倍(80μg/mL,12h),IL-18上升了14.5倍(80μg/mL,24h)。采用DCFH-DA試劑標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(ROS)產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)20、40、80μg/mL PSP可使ROS陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度上調(diào)1.2、2.7、3.2倍。綜上所述,PSP除能誘導(dǎo)凋亡外,還可使細(xì)胞體積發(fā)生膨大、激活caspase-1、上調(diào)IL-1β、IL-18基因的表達(dá)。這種機(jī)制可能為焦亡。
【圖文】：

白組分析的方法對(duì) THP-1 細(xì)胞裂解液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了 82 種 caspase-1 可能的物[42]。caspase-1 底物的不同誘導(dǎo)的下游反應(yīng)則不同。 Xinmao 等[43]人則發(fā)現(xiàn)spase-1 參與了蜱唾液腺的凋亡，當(dāng) RNA 干擾抑制后，唾液腺細(xì)胞凋亡延遲。的唾液腺中似乎存在另一種細(xì)胞死亡形式，這種現(xiàn)象可能是由涉及自噬相關(guān)基 4D 的代償性自噬引起的。在小鼠失血性休克模型的肝細(xì)胞中，活化 caspase-1于通過(guò)激活線粒體自噬阻止肝細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。休克和復(fù)蘇過(guò)程中 caspase-1激活增加了 beclin-1 的表達(dá)，beclin-1 是一種重要的自噬啟動(dòng)蛋白，可清除受的線粒體以減少過(guò)量 ROS 的產(chǎn)生[44]。caspase-1 在程序性細(xì)胞死亡中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，caspase-1 的失調(diào)與種疾病密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞中 caspase-1 表達(dá)較低，caspase-1 過(guò)表達(dá)可以抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[45, 46]。caspase-1 缺乏的小鼠腫瘤形成明顯增強(qiáng)，早期結(jié)腸上皮細(xì)增殖增加，晚期細(xì)胞凋亡減少。卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞中也有相同現(xiàn)象，暗示靶向 caspase-1 可能是腫瘤治療的一個(gè)新方向[47, 48]。

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1 PSP 對(duì) Molt-4 細(xì)胞增殖的影響采用光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度 PSP 組分與 Molt-4 細(xì)胞共孵育 48 小時(shí)細(xì)胞群生長(zhǎng)情況。隨著 PSP 組分濃度增加，細(xì)胞群分散，，細(xì)胞數(shù)目減少（圖 2.1）。80μg/mLPSP 處理 Molt-4 細(xì)胞的時(shí)效關(guān)系研究中也有相同趨勢(shì)（圖 2.2）。2.1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為 GraphPad Prism 5. 0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異用單因素方差檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P<0. 05 定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2679332