【摘要】：哮喘作為一種全球性的嚴(yán)重疾病,目前其一線治療方式為吸入糖皮質(zhì)激素。而部分哮喘患者體內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集類型不同,無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)藥物緩解癥狀。ABT-199小分子作為Bcl-2抗凋亡蛋白的抑制劑,可抑制哮喘炎癥相關(guān)細(xì)胞線粒體表面過(guò)表達(dá)的Bcl-2抗凋亡蛋白活性,進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡。然而ABT-199小分子藥具有很強(qiáng)的疏水性,且對(duì)細(xì)胞線粒體無(wú)靶向性,這大大影響了其藥物療效,因此亟需發(fā)展新的藥物遞送體系實(shí)現(xiàn)其有效遞送。納米給藥系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)藥物的高效遞送和炎癥相關(guān)細(xì)胞及胞內(nèi)的靶向,為哮喘疾病的治療提供了一種新思路。針對(duì)炎癥相關(guān)疾病病灶區(qū)域微環(huán)境具有微酸性及細(xì)胞溶酶體內(nèi)部酸性特點(diǎn),本論文設(shè)計(jì)了具有酸響應(yīng)性的納米載體。通過(guò)制備具有酸響應(yīng)能力的兩親性高分子,在水中與疏水性藥物形成載藥膠束,以哮喘作為疾病模型進(jìn)行對(duì)酸響應(yīng)納米制劑Nf-ABT-199治療效果的探究。本論文首先合成了具有酸響應(yīng)性的高分子。通過(guò)具有兩親性及高度生物安全性的氨基聚乙二醇高分子鏈作為R-氨基酸N碳酸酐開(kāi)環(huán)聚合反應(yīng)(ROP)的引發(fā)劑,連接聚氨基酸鏈。并通過(guò)簡(jiǎn)單的氨解反應(yīng)引入對(duì)酸敏感的咪唑基團(tuán),最終得到了酸響應(yīng)型嵌段高分子,并通過(guò)核磁共振波譜法對(duì)合成的酸響應(yīng)型嵌段高分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn);利用紫外分光光度計(jì)(UV-vis)測(cè)定酸響應(yīng)型嵌段高分子的透射率隨pH值的變化以研究其酸響應(yīng)性。當(dāng)環(huán)境pH值下降至其酸解離常數(shù)(pKa)時(shí),其基團(tuán)質(zhì)子化可引起表面電位的正增強(qiáng),從而提高藥物入胞,且通過(guò)靜電作用可進(jìn)一步靶向線粒體。隨后,本論文利用上述合成的酸響應(yīng)型嵌段高分子,包載Bcl-2抗凋亡蛋白抑制劑ABT-199小分子藥物,制備了肺部炎癥細(xì)胞內(nèi)酸環(huán)境響應(yīng)型線粒體靶向的ABT-199納米制劑(Nf-ABT-199),并進(jìn)一步用于哮喘疾病的治療研究。同時(shí),制備了不含ABT-199藥物的納米載體(Nanocarrier),作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)照。采用紫外分光光度計(jì)建立ABT-199含量測(cè)定方法學(xué),并對(duì)Nf-ABT-199的理化性質(zhì)及載體載藥量進(jìn)行考察;利用Zeta電位分析儀檢測(cè)Nf-ABT-199在不同pH條件下的電位變化,利用透射電子顯微鏡(TEM)、粒度電位分析儀(DLS)等手段考察其形貌、粒徑的酸響應(yīng)性變化。結(jié)果表明,Nf-ABT-1 99具有良好的酸響應(yīng)性。在較低的pH環(huán)境下,Nf-ABT-199表面電位上升呈現(xiàn)強(qiáng)正電性,納米粒體積膨脹。隨后,在細(xì)胞水平對(duì)Nf-ABT-199的胞內(nèi)溶酶體逃逸行為進(jìn)行考察。結(jié)果顯示,Nf-ABT-1 99進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生溶酶體逃逸現(xiàn)象,確認(rèn)了其胞內(nèi)行為。Nf-ABT-199納米制劑入胞后,在溶酶體的酸性環(huán)境中質(zhì)子化,通過(guò)質(zhì)子海綿效應(yīng)從溶酶體中逃逸,隨后靶向線粒體。接著,在細(xì)胞水平對(duì)Nf-ABT-199的線粒體靶向性能進(jìn)行評(píng)價(jià),與非響應(yīng)型的納米制劑(is-Nf-ABT-199)進(jìn)行對(duì)照。之后通過(guò)定量分析,比較不同實(shí)驗(yàn)組給藥后細(xì)胞線粒體上的藥物含量差異,對(duì)比靶向能力。結(jié)果表明,Nf-ABT-199能靶向細(xì)胞線粒體,在線粒體部位富集。進(jìn)一步,建立卵清白蛋白誘導(dǎo)的急性嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘小鼠模型,以氣道滴注方式給藥。通過(guò)統(tǒng)計(jì)肺部炎癥細(xì)胞數(shù)、相關(guān)炎癥因子水平、肺部組織切片染色、考察炎癥細(xì)胞凋亡情況等手段,對(duì)比ABT-199游離藥、is-Nf-ABT-199及Nf-ABT-199的治療效果。結(jié)果表明:1.Nf-ABT-199具有良好的肺部擴(kuò)散行為,能深入肺部深處,針對(duì)小氣道部位的炎癥治療效果顯著;2.Nf-ABT-199能有效減少肺部炎癥細(xì)胞數(shù),降低相關(guān)炎癥因子水平并顯著降低支氣管及血管周圍浸潤(rùn)現(xiàn)象,同時(shí)減少杯狀細(xì)胞產(chǎn)生,且能有效緩解哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性。且納米載體本身不影響小鼠的炎癥情況;3.Nf-ABT-199干預(yù)后的炎癥細(xì)胞表達(dá)casepase 3凋亡通路,引起炎癥細(xì)胞顯著凋亡。對(duì)Nf-ABT-199及納米載體的生物安全性進(jìn)行考察。利用CCK8法探究?jī)烧邔?duì)人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE的細(xì)胞毒性;流式分析術(shù)考察HBE細(xì)胞給藥后的凋亡情況;評(píng)估鈣依賴性跨膜糖蛋白(E-Cadherin)的損傷情況;測(cè)定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及乳酸脫氫酶(LDH)的水平以考察其肝毒性,并記錄分析實(shí)驗(yàn)小鼠造模及給藥期間的體重情況,考察其安全性。結(jié)果表明:1.Nf-ABT-199及納米載體均未對(duì)人支氣管上皮樣細(xì)胞造成毒性損害,不造成細(xì)胞的凋亡;2.Nf-ABT-199及納米載體均未造成E-Cadherin損傷,對(duì)氣道上皮無(wú)毒性作用;3.Nf-ABT-199及納米載體對(duì)動(dòng)物均不造成肝毒性也不影響小鼠正常體重變化。綜上,本文設(shè)計(jì)合成的納米載體包載藥物可得到酸響應(yīng)型線粒體靶向納米制劑(Nf-ABT-199)。Nf-ABT-199具備納米尺寸并大大提高藥物水溶性,促進(jìn)藥物的體內(nèi)遞送。并且,納米載體協(xié)助共載藥物在肺部炎癥部位深入、富集,實(shí)現(xiàn)氣管內(nèi)特異性。同時(shí)利用其酸響應(yīng)的電位增強(qiáng)性質(zhì),使其能從溶酶體酸性環(huán)境中逃逸并進(jìn)一步通過(guò)靜電作用實(shí)現(xiàn)有效的線粒體靶向遞送藥物。進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)Bcl-2抗凋亡蛋白的抑制作用,導(dǎo)致炎癥細(xì)胞凋亡。另外,Nf-ABT-199及納米載體具有生物安全性。這種酸響應(yīng)的線粒體靶向納米給藥體系,可以為設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)更多細(xì)胞器相關(guān)靶向藥物提供新思路。
【圖文】：

位優(yōu)勢(shì)靶向目標(biāo)細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)藥物的有效遞送［４８￣４９］。逡逑本章設(shè)計(jì)并合成了具有酸響應(yīng)性的納米載體，進(jìn)一步包載ＡＢＴ－１９９藥物，制逡逑備了酸響應(yīng)型線粒體靶向的ＡＢＴ－１９９納米制劑（圖２．１）。通過(guò)核磁共振波譜法逡逑ＣＮＭＲ）對(duì)合成的酸響應(yīng)型嵌段高分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析；利用透射電子顯微鏡逡逑（ＴＥＭ）、粒度電位分析儀（ＤＬＳ）等手段考察其形貌、粒徑的酸響應(yīng)性變化；并逡逑在細(xì)胞水平上驗(yàn)證其在細(xì)胞內(nèi)的線粒體靶向行為。逡逑■■曊逡逑�。垩藻义蠄D２．１炎癥細(xì)胞內(nèi)酸響應(yīng)型線粒體靶向的ＡＢＴ－１９９納米制劑的制備示意圖。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ａ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ邋ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ－ｔａｒｇｅｔｅｄ逡逑６逡逑

２．２＿２邋ＰＥＧ５ｋ－ｐ（ＡＰＩ－Ａｓｐ）５邋的合成逡逑２．２．２．１天冬氨酸環(huán)內(nèi)酸酐的合成逡逑天冬氨酸環(huán)內(nèi)酸酐的合成路線如圖２．２所示。利用金屬鈉塊對(duì)四氫呋喃除水，逡逑以二苯甲酮作為顯色劑使用，，當(dāng)溶液顏色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)，開(kāi)始蒸餾收集，得到無(wú)水逡逑四氫呋喃。將９邋ｇＬ－天門冬氨酸Ｐ－芐酯和９邋ｇ三光氣一起溶于上述除水的無(wú)水四氫逡逑呋喃中（１５０邋ｍｌ），６５°Ｃ油浴加熱，攪拌反應(yīng)３邋ｈ。之后停止反應(yīng)，將溶液至于室溫逡逑中冷卻。將冷卻后的反應(yīng)溶液用油相濾膜進(jìn)行過(guò)濾，之后緩慢滴入正己烷中。產(chǎn)逡逑物在正己烷中沉淀，之后用布氏漏斗及雙層濾紙對(duì)其進(jìn)行過(guò)濾。濾后，產(chǎn)物置于逡逑真空干燥箱中，室溫干燥過(guò)夜。將產(chǎn)物收集、稱重，得到天冬氨酸環(huán)內(nèi)酸酐逡逑（ＢＬＡ－ＮＣＡ）0逡逑0逡逑ＣＩ３Ｃ．邐／ＣＣＩ３逡逑ｒ邋１邐0邋Ｗ＝逡逑Ｌ－天門冬氨酸ｐ－芐酯邐ＢＬＡ－ＮＣＡ逡逑圖２．２天冬氨酸環(huán)內(nèi)酸酐合成路線圖。逡逑９逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943;R96

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本文編號(hào)：2674861