【摘要】：目的:為了提高雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)在體內(nèi)的循環(huán)時間,達(dá)到較好的抗瘧、抗腫瘤效果,合成以二硫鍵為連接臂,以十四胺、十八胺為載體修飾的雙氫青蒿素前藥(C14-SS-DHA、C18-SS-DHA);以碳碳鍵為連接臂,以十四胺、十八胺為載體修飾的雙氫青蒿素前藥(C14-CC-DHA、C18-CC-DHA)。通過考察四種雙氫青蒿素前藥制備的自組裝納米粒的制劑學(xué)特征、在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征、對約氏瘧鼠的抗瘧活性、對4T1細(xì)胞的增殖抑制作用、對4T1荷瘤小鼠的抗腫瘤活性,為小分子雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒在治療瘧疾和抗腫瘤應(yīng)用提供基礎(chǔ)和指導(dǎo)。方法:1.四種雙氫青蒿素前藥的合成及表征以十四胺、十八胺、二硫代二丙酸、DHA、青蒿琥酯(Artesunate,AS)為原料藥,發(fā)生脫水縮合反應(yīng)、酯化反應(yīng)、酰胺化反應(yīng)合成四種雙氫青蒿素前藥。采用高分辨質(zhì)譜(HR-MS)、氫譜(1H-NMR)對終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。2.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒制備及制劑學(xué)性質(zhì)考察采用納米沉淀法制備雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒,以粒徑和PDI為指標(biāo)對處方進(jìn)行單因素優(yōu)化;并考察制備的雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的初步穩(wěn)定性;建立高效液相-柱后衍生化法測定雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的包封率和載藥量;應(yīng)用小杯法評價四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的體外釋放行為。3.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究DHA溶液和雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒分別尾靜脈注射至大鼠體內(nèi)后于不同時間點(diǎn)取血,使用液液萃取法提取大鼠血漿的DHA及其前藥。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)法測定大鼠血漿中DHA和雙氫青蒿素前藥的含量。采用Kinetex?C8色譜柱,10 m M乙酸銨溶液∶乙腈=10∶90的流動相,青蒿素(Artemisinin,ART)為內(nèi)標(biāo),在300μl/min的流速下使用ESI源以多反應(yīng)監(jiān)測的方式(MRM)進(jìn)行陽離子監(jiān)測,通過監(jiān)測m/z 302.3→163.2(DHA),m/z 689.1→300.2(C14-SS-DHA),m/z 597.1→314.3(C14-CC-DHA),m/z 745.2→356.1(C18-SS-DHA),m/z 653.2→370.3(C18-CC-DHA),m/z 300.1→151.1(ART IS)確定DHA和前藥的含量。應(yīng)用統(tǒng)計矩方法,計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)。4.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的體內(nèi)抗瘧活性建立約氏瘧鼠模型,采用皮爾遜四天抑制給藥法尾靜脈注射給予五種劑量的DHA溶液和四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒溶液。停藥1天,取血、涂片、染色、鏡檢,計算感染率、抑制率、ED50(50%有效劑量)、ED90(90%有效劑量)。停藥7天,再次取血、涂片、染色、鏡檢,計算感染率。記錄小鼠的存活天數(shù)。5.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的體內(nèi)外抗腫瘤活性評價以4T1細(xì)胞為模型細(xì)胞,采用MTT法對DHA溶液和四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的細(xì)胞毒性進(jìn)行初步研究。通過比較IC50結(jié)果對不同制劑的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價。以皮下接種4T1細(xì)胞的Balb/c鼠為模型動物,小鼠尾靜脈注射DHA溶液和四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒溶液對其抗腫瘤活性進(jìn)行研究。通過比較不同組小鼠的腫瘤生長曲線、小鼠體積變化及腫瘤負(fù)荷,評價各個制劑的抗腫瘤活性。結(jié)果:1.四種雙氫青蒿素前藥的合成和表征四種雙氫青蒿素前藥經(jīng)HR-MS、1H-NMR驗(yàn)證,均成功合成。C14-SS-DHA為淡黃色粘稠的液體,產(chǎn)率為58%;C14-CC-DHA為白色塊狀固體,產(chǎn)率為75%,C18-SS-DHA為淡黃色蠟狀固體,產(chǎn)率為61%;C18-CC-DHA為白色蠟狀固體,產(chǎn)率為77%。2.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒制備及制劑學(xué)性質(zhì)考察采用單因素優(yōu)化后的處方分別制備四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒溶液,得到的自組裝納米粒呈類球形,分布均勻,粒徑在100~140 nm之間,PDI均小于0.3,Zeta電位的絕對值在20~45 m V之間,包封率在93%~97%之間,載藥量在79%~80%之間。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)說明四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒溶液在4℃環(huán)境下至少可穩(wěn)定保存一個月。C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs中的前藥在6個小時內(nèi)累計釋放量分別達(dá)到80.3%、79.2%、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs中的前藥在6個小時內(nèi)累計釋放量分別達(dá)到72.9%、71.2%。C14-SS-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs在二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)存在的條件下,60 h內(nèi)DHA的釋放量分別達(dá)到40%、62%。3.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究尾靜脈注射DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs至大鼠體內(nèi)后,血漿中DHA的血藥濃度時間曲線下面積(AUC0-t)分別為:908.9±82.3、23211.5±9101.9、4221.5±540.0、748.7±221.7、13212.2±1765.1h·μg·L-1,AUC0-t的大小順序?yàn)镃14-SS-DHA NPsC18-CC-DHA NPsC14-CC-DHA NPsDHA溶液C18-SS-DHA NPs;MRT分別為:0.3±0.1、0.9±0.3、0.2±0.1、1.7±0.3、1.6±0.3 h,MRT的大小順序是:C18-SS-DHA NPs≈C18-CC-DHA NPsC14-SS-DHA NPsDHA溶液≈C14-CC-DHA NPs。C14-CC-DHA NPs注射至大鼠體內(nèi)未測到前藥,C14-SS-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs在大鼠血漿中前藥的AUC0-t分別為24179.2±1885.5、92525.3±25760.4、64123.3±14088.2 h·μg·L-1;MRT分別為0.8±0.1、1.1±0.3、1.3±0.4 h。4.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的體內(nèi)抗瘧活性停藥1天后,測得C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs的ED50值分別為:0.14±0.05、0.20±0.09、0.03±0.01、0.04±0.01μmol/kg與DHA組(0.87±0.27μmol/kg)相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。停藥1周后,各組瘧原蟲的感染率均有所上升,但相比DHA溶液組,四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒給藥組感染率上升速度較慢。各個濃度四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒給藥組的平均存活時間均長于DHA溶液組。同一制劑給藥組隨著給藥劑量的增加,瘧原蟲的感染率逐漸減低,有劑量依賴性。5.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的體內(nèi)外抗腫瘤活性評價DHA溶液組和四種雙氫青蒿素自組裝納米粒給藥組對4T1細(xì)胞的增殖抑制作用均隨著藥物濃度的增加和孵育時間的延長而增強(qiáng),有劑量依賴性和時間依賴性。測得DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs、C18-CC-DHA NPs與細(xì)胞共孵育48 h的IC50值分別為:2.60±0.22、2.05±0.05、2.52±0.20、3.43±0.10、3.86±0.10μmol/L。腫瘤生長曲線結(jié)果表明,相比Saline組,DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs組的腫瘤生長速度慢。Saline組、DHA溶液、C14-SS-DHA NPs、C14-CC-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs組的腫瘤負(fù)荷分別為:(13.4±2.2)%、(7.8±0.67)%、(5.5±1.3)%、(9.4±0.5)%、(7.2±0.2)%和(5.9±0.6)%。結(jié)論:1.分別合成以二硫鍵或碳碳鍵為連接臂,以十四胺、十八胺為載體的四種雙氫青蒿素前藥。2.制備得到四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒,外觀呈圓整的類球形,具有較小的粒徑,較高的包封率和載藥量,在4℃條件下可穩(wěn)定保存一個月,在DTT存在的條件下,C14-SS-DHA NPs、C18-SS-DHA NPs中的DHA有較快的釋放。3.四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒大鼠尾靜脈注射后,在不同程度上延長了DHA的平均滯留時間,提高了AUC,可能對該類藥物的藥效學(xué)有積極的作用。4.瘧鼠尾靜脈注射后,隨給藥劑量的增大,抗瘧作用逐漸增強(qiáng)。四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的抗瘧活性均強(qiáng)于DHA溶液(P0.05);同種連接臂的前藥,十八胺為載體的前藥自組裝納米粒有更好的抗瘧活性;同種脂肪胺為載體的前藥,含有二硫鍵的前藥抗瘧活性強(qiáng)于以碳碳鍵為連接臂的前藥。5.不同的雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒作用隨著給藥劑量的增加、孵育時間的延長,而增大。同種連接臂的前藥,十四胺修飾的雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒對4T1細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于十八胺修飾的雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒;同種脂肪胺為載體的前藥,以二硫鍵為連接臂的雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒的細(xì)胞毒性強(qiáng)于以碳碳鍵為連接臂的雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒。四種雙氫青蒿素前藥自組裝納米粒對4T1荷瘤小鼠腫瘤的生長均有一定的抑制作用,其中C14-SS-DHA NPs和C18-CC-DHA NPs抗腫瘤效果最好。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文步，3, 3'-二硫代二丙酸（結(jié)構(gòu)見圖 1-1a）自身羧基脫水合成二硫代二丙酸酐（結(jié)構(gòu)見圖 1-1b）。第二步，二硫代二丙酸酐與雙氫青蒿素發(fā)生酯化反應(yīng)生成二硫代二丙酸的單雙氫青蒿素取代結(jié)合物（DHA-SS-COOH，結(jié)構(gòu)見圖 1-1c）。第三步，，DHA-SS-COO分別與十四胺、十八胺反應(yīng)生成二硫鍵為連接臂的雙氫青蒿素前藥（C14-SS-DHA、C18-SS-DHA 結(jié)構(gòu)見圖 1-1d）。

圖 1-2 碳碳鍵為連接臂脂肪胺修飾的雙氫青蒿素前藥合成1.2.1 二硫代二丙酸酐的合成取 0.2 g 二硫代二丙酸，精密稱定，置于 100 ml 茄型瓶中，加入 3 ml 乙酸酐使之溶解，于 30 ℃水浴條件下反應(yīng) 3.5 h。反應(yīng)結(jié)束后分 3 次加入 2 ml 甲苯，于 37 ℃條件下減壓旋蒸除去乙酸酐。1.2.2 雙氫青蒿素-二硫代二丙酸的合成取 90 mg 雙氫青蒿素，3.8 mg DMAP，精密稱定，加入 1.2.1 項(xiàng)下產(chǎn)物中，加入適量二氯甲烷溶解樣品，于 35 ℃下反應(yīng) 36 h。反應(yīng)結(jié)束后，使用薄層大板分離純化樣品（展開劑：環(huán)己烷 乙酸乙酯 冰乙酸=3 1.5 0.1），選取紫外燈 254 nm 下Rf 值在 0.4 - 0.6 之間的最濃條帶，劃線標(biāo)記，刮取標(biāo)記條帶的硅膠粉置于 100 ml 的茄型瓶中加入適量二氯甲烷覆蓋硅膠粉，并加入 2 ml 甲醇在室溫下攪拌過夜，用砂
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R943

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本文編號：2674491