【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體屬于膜蛋白家族,可以把細(xì)胞外信號傳遞到胞內(nèi),通過介導(dǎo)多種效應(yīng)系統(tǒng)引起細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng),在激素分泌、細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞分化成熟等方面都發(fā)揮著重要作用,因此G蛋白偶聯(lián)受體是臨床治療疾病的重要靶點之一。G蛋白偶聯(lián)受體120(G protein-coupled receptor 120,GPR120),又稱游離脂肪酸受體4(FFAR4),是G蛋白偶聯(lián)受體中視紫紅質(zhì)家族的一種,近年來通過對其配體的研究,發(fā)現(xiàn)GPR120參與介導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化成熟、胰島素分泌、細(xì)胞的增殖凋亡以及抗炎等多種生理活動,目前也是治療Ⅱ型糖尿病、肥胖癥的重要研究靶點。G蛋白偶聯(lián)受體40(GPR40)又稱游離脂肪酸受體1(FFAR1),GPR40和GPR120結(jié)構(gòu)相近,具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體的七次跨膜結(jié)構(gòu),雖然兩者都可以被游離脂肪酸激活,但是兩者在不同種類細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)水平存在差異,生物學(xué)功能也不盡相同。激活GPR40信號通路會促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖與遷移,而GPR120起負(fù)向調(diào)控作用,但在骨肉瘤細(xì)胞中兩者作用相反。深入研究GPR120功能對腫瘤的預(yù)防和治療具有重要指導(dǎo)意義。在細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸通過β-氧化可以為機(jī)體提供能量和維持生命體正常運(yùn)行的中間體,同時也可以作為內(nèi)源性配體,激活胞內(nèi)或膜上受體,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPR120可以被中鏈和長鏈的脂肪酸活化。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一種ω-3不飽和脂肪酸,主要存在植物和魚油中,是GPR120和GPR40的配體,具有多種生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)DHA通過GPR120抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;但也有研究報道DHA的抗腫瘤作用與GPR120沒有必然關(guān)聯(lián)。由于機(jī)體微環(huán)境的差異以及腫瘤的多樣性,作為GPR120配體的DHA的生物學(xué)功能以及潛在的機(jī)制還有待研究。DHA具有抑制腫瘤增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能,而GPR120信號通路又和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),另外DHA又是GPR120的配體,故本課題的目的是研究DHA對肺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響以及DHA是否通過GPR120受體發(fā)揮生物學(xué)作用,為此本課題主要研究了 DHA對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移的影響,以及借助于GPR120小分子選擇性激活劑和抑制劑,研究DHA的抗腫瘤活性與GPR120受體的關(guān)系。本課題主要運(yùn)用SRB實驗、Transwell實驗、劃痕實驗以及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)方法,研究DHA對H460肺癌細(xì)胞株的生物活性的影響,研究GPR120受體被選擇性抑制劑AH-7614或者激活劑TUG-891作用后DHA的抗腫瘤活性是否發(fā)生變化。本論文結(jié)果顯示DHA抑制H460肺癌細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)濃度依賴性;DHA對H460細(xì)胞遷移的劃痕實驗結(jié)果表明DHA能夠抑制H460肺癌細(xì)胞的遷移,90 μmol/L的DHA具有明顯的抑制特性,且隨濃度升高而增強(qiáng)。本研究未發(fā)現(xiàn)DHA對H460細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用。GPR120在選擇性抑制或激活的情況下,DHA對H460細(xì)胞的增殖抑制具有明顯增強(qiáng)作用,但并無顯著性差異。抑制劑AH-7614和激活劑TUG-891對H460細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移不具有顯著性抑制作用,然而抑制劑AH-7614可以明顯增強(qiáng)DHA對細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移的抑制作用,激活劑TUG-891不影響DHA對細(xì)胞遷徙轉(zhuǎn)移的抑制作用。結(jié)果可能預(yù)示著在H460細(xì)胞株中DHA的抗腫瘤活性可能不通過GPR120受體,但具體機(jī)制還需進(jìn)一步驗證。為深入研究DHA與GPR120受體之間的關(guān)系本課題構(gòu)建了 GPR120基因敲除質(zhì)粒載體,然后包裝成病毒顆粒,感染細(xì)胞后經(jīng)篩選和鑒定,獲得3個GPR120基因敲除的H460肺癌細(xì)胞株;構(gòu)建了 GPR120高表達(dá)質(zhì)粒載體,并通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞,獲得3個GPR120高表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞株;GPR120基因敲除和高表達(dá)的細(xì)胞株的分別獲得為深入研究DHA與GPR120受體之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

ｃｒＲＮＡ對外源基因識別、ｔｒａｃｒＲＮＡ對相關(guān)的核酸內(nèi)切酶的靶向招募，ＣＲＩＳＰＲ相逡逑關(guān)的核酸內(nèi)切酶發(fā)揮核酸編輯作用，對外源基因進(jìn)行酶切，其中ｃｒＲＮＡ和逡逑ｔｒａｃｒＲＮＡ己經(jīng)被人為的融合成了單一的合成導(dǎo)向ＲＮＡ邋（ｓｇＲＮＡ），如圖１－１＿。逡逑其中ＰＡＭ是一個核苷酸串聯(lián)鳥嘌呤核苷ＮＧＧ位點，與基因編輯定位相關(guān)，在逡逑其上游大概３ｂｐ位置，Ｃａｓ９蛋白發(fā)揮酶切編輯功能［２９］。運(yùn)用該系統(tǒng)進(jìn)行基因編逡逑輯操作簡單，價格低廉，相比較鋅指核酸酶編輯系統(tǒng)具有更高的誘變效率，而且逡逑具有更低的脫靶情況［２６］。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９目前已經(jīng)運(yùn)用到了真核生物的基因編輯逡逑中，隨著這一系統(tǒng)的完善，有望運(yùn)用到人體的基因治療方面［３１］。逡逑１０逡逑

倒掉染色液，用１邋％（Ｖ／Ｖ）現(xiàn)配的乙酸溶液清洗４次，室溫自然晾干，大概２ｍｉｎ；逡逑（９）每孔加入Ｔｒｉｓ－ｂａｓｅ堿溶液１５０邋｜ｉＬ邋（１０邋ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝１０．５）溶解細(xì)胞的染料，，放置在水平搖床２０邋ｍｉｎ，酶標(biāo)儀５４０邋ｎｍ檢測吸光度。逡逑３．實驗結(jié)果逡逑３．１不同細(xì)胞株ＧＰＲＩ２０和ＧＰＲ４０的蛋白表達(dá)水平的測定逡逑培養(yǎng)細(xì)胞并收集蛋裂解液進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ實驗，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)ＨｅｐＧ２、乳腺癌細(xì)胞４Ｔ１和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１邋（圖中為２３１）、肺癌細(xì)胞Ｈ１２９９Ｈ４６０、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞ＳＹ５Ｙ以及人結(jié)腸癌細(xì)胞ＨＣＴ１１６中，ＧＰＲ４０ＧＰＲ１２０均有表達(dá)，且在不同細(xì)胞間蛋白表達(dá)水平存在差異，如圖２－１所示。逡逑ＧＰＲ４０ｍｍｍ橚＿丨＿邐邐邐逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2671089